介绍

目前，二甲双胍仍是世界范围内治疗2型糖尿病(T2D)的一线药物选择1,2。然而，尽管人们提出使用二甲双胍有许多有益的作用，但研究发现，长期使用该药通常会导致T2D患者缺乏B12，患病率高达41%3,4,5。缺乏B12的个体通常表现为神经病变，症状包括共济失调、认知能力下降、小细胞增多的血液学异常和巨幼细胞性贫血6。具体而言，二甲双胍诱导的低B12状态与认知功能下降和抑郁风险增加有关，通常发现在脱髓鞘和神经变性发生时，这是不可逆的7,8,9。

由于B12在DNA合成和氨基酸及脂肪酸代谢中起着重要作用，因此它对细胞生长和体内平衡是必不可少的。人类和大多数小肠微生物完全依赖饮食来源的B12，因为他们缺乏B12的生物合成基因11,12。饮食中的B12最初在胃中释放，在胃中与内在因子结合形成复合物，然后与回肠远端的cubilin受体结合，最终被送到肝脏储存。肝脏中储存的B12量通常足以满足生理需要，因此很难通过实验诱导B12缺乏模型进行机制研究14,15。可能，至少在一定程度上，由于缺乏健全的B12缺乏模型，二甲双胍诱导的B12缺乏的机制在很大程度上仍然未知。

大量证据表明，二甲双胍通过改变肠道微生物群来发挥其有益作用，包括抗高血糖和抗衰老作用16,17,18,19,20。有趣的是，据报道，双胍类药物相关的B12缺乏症可以通过服用抗生素来逆转，这表明细菌在双胍类药物诱导的人类B12吸收不良中发挥了潜在的作用。值得注意的是，宿主对二甲双胍和B12的摄取是通过回肠远端发生的，那里存在大量的B12营养不良肠道微生物，为药物、B12和微生物之间的潜在相互作用提供了一个平台。最近的一项研究也表明，细菌B12转运蛋白可能通过解离宿主内在因子-B12复合物来帮助微生物群与宿主争夺B12 22。此外，肠道菌群对B12的消耗被认为是某些人类疾病(如盲环综合征)中B12吸收不良的主要原因23,24。然而，二甲双胍是否通过肠道微生物影响宿主B12水平仍不清楚。

与人类与肠道微生物之间的共生关系不同，秀丽隐杆线虫直接将细菌作为食物来源，使其成为检测细菌中B12水平的合适工具25,26。在本研究中，我们通过对蠕虫体内B12活性的功能分析和对细菌B12水平的直接测量，证明了双胍类药物显著增加了多种大肠杆菌菌株中B12的含量。有趣的是，双胍类化合物诱导的B12积累完全依赖于功能性B12转运蛋白的活性。在机制上，我们发现这两种双胍类化合物都可以增加大肠杆菌中某些重要的B12转运基因的表达，特别是tonB，这表明双胍类化合物促进细菌中B12积累的可能机制。利用大肠杆菌Keio集合文库对b12敏感蠕虫模型(25、26、27)进行全基因组筛选，其中以tonB突变菌克隆为阳性对照，发现生物膜形成过程和跨膜运输是最富集的途径。从这些富集通路中敲除基因显著削弱了苯双胍提高细菌B12水平的作用。通过另一轮的窄过滤，我们进一步确定转录因子RcdA(一种ter型转录因子28,29)是导致大肠杆菌中双胍类物质增加的B12积累的元件。此外，我们证明了双胍介导的相应B12转运蛋白基因表达增加需要RcdA，这表明RcdA在二甲双胍暴露时作用于B12转运蛋白的上游。总之，我们的研究不仅为双胍类药物帮助细菌从环境中捕获B12的作用机制提供了见解，而且为理解肠道微生物群在长期使用二甲双胍引起的T2D患者B12缺乏中的作用奠定了基础。

结果

二甲双胍和苯双胍促进细菌B12积累

为了研究双胍类药物是否可以改变细菌中B12的水平，我们采用了nhr-114(以下简称为∆nhr-114)蠕虫模型，这是我们等人新提出的B12缺乏模型[25,27]。从表型上看，这些动物表现出B12剂量依赖性的生育能力。有趣的是，我们发现双胍类药物的不孕挽救作用完全依赖于B12的存在，而在B12缺乏的情况下，B12会消失(图1a)。为了确定双胍是否通过细菌提高蠕虫体内B12水平，我们使用了成熟的B12传感器Pacdh-1::GFP蠕虫，其GFP强度可以指示饮食中存在的B12水平26,30,31。我们在无菌培养系统中给Pacdh-1::GFP蠕虫喂食苯双胍(图1b-d)，或者给传感器蠕虫喂食药物预处理的大肠杆菌BW25113(图1b, f)，这是另一种广泛用于机制研究的大肠杆菌菌株32,33,34。令人惊讶的是，我们发现双胍类药物只有在细菌存在的情况下才会增加B12感知蠕虫体内的B12水平，这表明双胍类药物促进了细菌而不是蠕虫体内B12的积累。为了可能模拟细菌长期暴露于低剂量双胍类药物治疗的患者的生理状况，我们探索了与我们研究中主要应用的条件相比，较低剂量的苯双胍是否可以在相对较长的治疗时间内诱导细菌B12积累。事实上，我们发现细菌中的B12水平随着时间的推移增加了2mm(补充图1)，这表明在长期和低剂量二甲双胍治疗期间，细菌对B12的吸收增加可能发生在T2D患者中。

图1:抗糖尿病的双胍类药物促进细菌B12积累。
figure 1

a Δnhr-114动物在50 mM二甲双胍/5 mM苯双胍处理的正常NGM板或b12缺失NGM板上的繁殖力。阿明费、车辆。见面的时候,二甲双胍。苯酚的,苯乙双胍。N = 3个独立实验，每组至少30只蠕虫。b用B12和/或苯双胍处理线虫的无菌培养方案。c在无菌培养中添加B12和/或4 mM苯双胍的Pacdh-1::GFP蠕虫的代表性图像。d定量(c)中Pacdh-1::GFP虫的相对GFP强度。N = 3个独立实验，每个条件至少含有30只虫。e BW25113饲喂Pacdh-1::GFP虫的处理方案。f用B12和/或200 mM二甲双胍/4 mM苯双胍预处理的BW25113饲喂Pacdh-1::GFP虫的代表性图像。N = 3个独立实验，每个条件至少包含30只蠕虫。(c)和(f)的比尺:250 μm(荧光图像)和500 μm(亮场图像)。g LC-MS/MS测量200 mM二甲双胍/4 mM苯双胍处理BW25113中B12水平。Ado-Cbl adenosylcobalamin;CN-Cbl,维生素b12。二甲双胍组N = 2个独立实验，N =3个独立实验，每次试验至少3个单菌落。统计显著性值由(a)和(d)的普通单因素方差分析和(g)的非配对t检验确定。误差条表示S.E.M.

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为了研究双胍类药物对细菌中B12水平的确切影响程度，我们采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术测量了药物治疗前后细菌中B12水平的变化。结果表明，这两种药物显著增加了细菌中腺苷钴胺素(Ado-Cbl)和氰钴胺素(CN-Cbl)形式中B12的积累(图1g)。理论上，CN-Cbl形式是B12的外源补充形式，而Ado-Cbl形式应在活菌内部由CN-Cbl转化35,36。有趣的是，我们发现，与二甲双胍在200 mM诱导的结果相比，4 mM的苯双胍诱导的CN-Cbl积累要高得多，但Ado-Cbl水平较低(图1g)，这可能表明，在其他应用中报道的苯双胍相比，苯双胍在阻断细菌从CN-Cbl转化Ado-Cbl的活性更强37,38。总之，这些结果表明双胍类化合物促进细菌从环境中积累B12。

B12运输系统是苯双胍诱导的细菌B12积累所必需的

我们给秀丽隐杆线虫研究中常用的大肠杆菌菌株(包括OP50、HT115和HB101)同时服用或不服用phenformin和B12，以探讨该药物是否能提高不同细菌类型中B12的积累。然后将处理过的细菌喂给B12传感器蠕虫并使用LC-MS/MS测量来检测。事实上，我们发现phenformin在K12 x B杂交菌株HB101和K12菌株HT115中强烈诱导B12积累(图2a和补充图2a)。然而，B菌株OP50从环境中积累B12的能力似乎比其他菌株更弱，无论是否处理过苯双胍，这与B12传感器动物的GFP强度和LC-MS/MS对B12水平的测量结果一致(图2a和补充图2a)。

图2:B12转运机制在苯双胍介导的细菌B12积累中起重要作用。
figure 2

a用B12和/或4 mM苯双胍预处理的菌株OP50、HT115和HB101喂养的Pacdh-1::GFP蠕虫的代表性图像。N = 3个独立实验，每组至少30只蠕虫。b大肠杆菌中B12转运机制示意图。c - d OP50、BW25113和HT115细菌(c)和BW25113在200 mM二甲双胍/4 mM苯双胍处理或不处理(d)时参与B12转运的基因相对mRNA水平。(c, d)， N = 2个独立实验，包含4 - 6个重复。统计学显著性值采用多重t检验。误差条表示用B12和/或4 mM苯双胍预处理的WT和B12转运体突变株喂养的Pacdh-1::GFP蠕虫的s.e.m.e代表性图像。WT, BW25113。N = 3个独立实验，每组至少30只蠕虫。(a)和(e)的比例尺分别为250 μm(荧光图像)和500 μm(明场图像)。

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有文献表明，大肠杆菌需要一个主动运输系统从环境中吸收B12，以促进生长和生存。B12通常由BtuB通过外膜转运到外周质，这依赖于TonB复合物(由TonB、ExbB和ExbD组成)传递的能量。在周质中，B12被BtuF捕获并传递给atp结合盒转运体BtuCD，并最终释放到细胞质中(图2b)。因此，我们推测OP50菌株B12积累能力弱可能是由于控制B12运输的基因活性或表达较低。有趣的是，我们发现，与BW25113或HT115相比，OP50菌株所有测试的B12转运基因的表达量都明显低于BW25113或HT115(图2c)，这解释了其吸收B12的性能比其他菌株差，以及苯双胍的作用减弱(图2a和补充图2a)。考虑到B12转运蛋白的活性与细菌吸收B12的内在能力之间的密切联系，我们想知道B12转运基因的表达是否被苯双胍治疗改变了。事实上，我们发现二甲双胍和苯双胍都能诱导大部分B12转运体基因的表达，其中tonB的表达最为显著(图2d)。此外，我们证实，tonB、btuB和btuF的缺失可以显著消除苯双胍诱导BW25113中B12积累的作用(图2e)，尽管并非所有测试的基因都来自B12运输系统(补充图2b)。总的来说，我们的研究结果表明，B12运输系统可能通过其守门功能，对大肠杆菌中苯双胍诱导的B12水平至关重要。

介导双胍类药物在细菌中的作用的高通量基因筛选

为了确定双胍类化合物对细菌B12积累的遗传机制，我们利用Δnhr-114动物建立了遗传筛选，这些动物的生殖可以被B1225、27和B12传感器蠕虫菌株Pacdh-1::GFP完全恢复。为了更好地设计筛选，我们比较了这两种蠕虫模型在补充不同剂量B12时的敏感性，发现Δnhr-114读数显示对低剂量B12的敏感性高于GFP传感器菌株，特别是当0.05 nM B12与苯双胍共同给菌时(图3a, b)。为了评估细菌突变体对蠕虫繁殖的影响，我们将tonB突变株作为阳性对照。其中基础B12吸收和苯双胍介导的B12诱导均被发现受损(图2e)。根据Δnhr-114的低繁殖力，我们证实了苯双胍在ΔtonB诱导细菌中B12积累的作用显著降低(图3c和补充图3a)。因此，我们对3985个细菌突变体进行了初级无偏筛选，从Δnhr-114生殖力读数开始(图3d和补充图3b)，然后使用B12传感器动物Pacdh-1::GFP进行二次筛选，以缩小选择范围(图3e)。从初级筛选中，我们鉴定出274个候选基因，敲除后显著降低了苯双胍对细菌B12积累的影响(补充数据1)。基因本体分析显示，生物膜形成和跨膜运输是最显著富集的生物过程(图3f和补充数据1)。从二级筛选中，筛选出28个候选基因。其中ΔtonB得分最高(图3g和补充图3c)。

图3:用蠕虫B12传感器鉴定苯双胍效应物的细菌遗传筛选。
figure 3

a用不同剂量的B12和/或4 mM苯双胍预处理过的BW25113饲喂Pacdh-1::GFP虫的代表性图像。N = 3个独立实验，每组至少30只蠕虫。b饲喂饲喂不同剂量B12和/或2 mM苯双胍预处理的BW25113的Δnhr-114蠕虫的繁殖力。N = 5个独立实验，每个实验1-2个重复。c饲喂WT和ΔtonB细菌(分别用0.05 nM B12和/或2 mM苯双胍预处理)的Δnhr-114蠕虫的繁殖力。N = 4个独立实验，每次1-2个重复。通过双因素方差分析(b, c)确定统计显著性值。误差条表示负责苯双胍介导的细菌B12积累的基因的s.e.m.d, e遗传筛选方案。繁殖力屏幕(d)。不育和可育Δnhr-114蠕虫的漫画改编自我们之前的工作25。整个文库的筛选使用Δnhr-114蠕虫，用2 mM的苯双胍和0.05 nM的B12处理。N = 4个独立实验，每孔每轮至少30只蠕虫。GFP强度筛选(e)。使用4 mM苯双胍和1 nM B12处理的Pacdh-1::GFP蠕虫，从繁殖力筛选中共筛选274个命中。N = 3个独立实验，每孔每轮至少30只蠕虫。f从繁殖力筛选中获得274个hit的生物过程富集分析。g Pacdh-1::GFP虫在WT和GFP强度屏幕上的28个命中的荧光评分。(a)和(g)的比例尺:250 μm(荧光图像)和500 μm(明场图像)。

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双胍类化合物通过调节RcdA诱导细菌生长抑制和B12积累

为了确定双胍类药物在28种药物作用中发挥最一致作用的靶基因，我们纳入了双胍类药物的另一个特性——细菌生长抑制(图4a)，其表型被认为与双胍类药物的其他作用密切相关41。我们首先验证了phenformin在四种不同的大肠杆菌菌株中的生长抑制作用(Supplementary Fig. 4)，然后探索这种作用是抑菌还是杀菌。结果显示，5 mM的phenformin处理延缓了大肠杆菌的生长，并使活细胞数量略有减少，说明phenformin抑制了细菌的生长，但没有杀死细菌(Supplementary Fig. 5a)。此外，根据OD600测定和dsDNA结合染料SYBR Green I染色显示的细胞密度和完整性，5mm苯双胍确实对细菌生长产生了双重抑制作用(补充图5b, c)。综上所述，我们得出苯双胍的生长抑制作用主要是抑菌作用。

图4:双胍类化合物通过RcdA诱导细菌生长抑制和B12积累。
figure 4

a生长抑制筛选方案。采用光密度法评价5 mM苯双胍处理后28株次生筛选株的生长状况。b生长抑制筛选结果。OD600值测量WT， ΔyqjC， ΔymcC， ΔrcdA。N = 2个独立实验，共6个重复。c 4 mM苯双胍处理后WT、ΔrcdA和ΔrcdA::rcdA细胞的生长情况。N = 2个独立实验，包含2 - 5个重复。d分别饲喂4 mM苯双胍/200 mM二甲双胍预处理的WT、ΔrcdA和ΔrcdA::rcdA的Pacdh-1::GFP蠕虫的代表性图像。N = 3个独立实验，每组至少30只蠕虫。比例尺:250 μm(荧光图像)、500 μm(明场图像)。e 4 mM phenformin处理或未处理WT和ΔrcdA中B12水平的LC-MS/MS测定。N = 3个独立实验，每组4-5个重复。f 200 mM二甲双胍和4 mM苯双胍组rcdA相对mRNA水平。g 200 mM二甲双胍或4 mM苯双胍治疗ΔrcdA中参与B12转运的基因相对mRNA水平。对于(f, g)， N = 2个独立实验，包含4-6个重复。统计显著性值由(b)和(e)的普通单因素方差分析和(c)和(f, g)的多重t检验确定。误差条表示标准差

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我们推断，药物靶基因的缺失将赋予突变菌株对高浓度苯双胍的抗性。有趣的是，28个候选体中只有3个能在苯双胍治疗下生长，其中∆rcdA对该药的耐药性最为显著(图4b)。此外，RcdA是一种转录因子，控制许多参与生物膜形成的重要基因的表达28，这些基因是最初筛选之外的候选基因(图3f)，这表明RcdA可能是决定双胍类药物诱导细菌B12积累效果的关键因素。为了检验RcdA是否通过调节药物蓄积来介导苯双胍的作用，我们采用LC-MS/MS法测定了∆RcdA中的药物水平。结果显示，与WT相比，缺失rcdA并没有改变细菌中苯双胍的积累量(Supplementary Fig. 6)，这表明rcdA介导了药物的活性，而不是其在细菌中的水平。

为了证实RcdA在介导苯双胍对细菌生长抑制和B12积累的双重作用，我们在RcdA突变菌株中重新表达了RcdA蛋白。RcdA的互补表达几乎完全恢复了细菌对双胍处理的敏感性和B12积累特性(图4c, d)。通过LC-MS/MS，我们更直接地测量了WT和ΔrcdA中有或没有药物治疗的B12水平。与B12传感器动物的结果一致(图4d)，与WT相比，rcdA的缺失显著降低了苯双胍促进Ado-Cbl和CN-Cbl形式的B12积累的作用(图4e)。然后，我们检测了rcdA的基因表达，发现两种双胍处理后rcdA的基因表达显著增加(图4f)。总的来说，这些结果表明双胍类化合物通过增加rcdA的表达来促进细菌B12的积累。

为了探讨rcdA缺失是否通过调节B12转运蛋白来消除双胍类药物的作用，我们检测了双胍类药物处理或不处理的∆rcdA中B12转运蛋白基因的表达。结果显示，二甲双胍和苯双胍都不能像在WT中那样上调∆rcdA中这些基因的表达(图2、4)。令人惊讶的是，这两种双胍甚至通过一种未知的机制降低了∆rcdA中btuB或btuD的表达(图4)。这表明在双胍处理下可能存在独立于RcdA的平行通路调节B12转运体基因的表达。总之，我们的研究结果表明，双胍类化合物通过促进B12转运体基因的表达来提高细菌从环境中摄取B12，这可能会导致环境(宿主)随着时间的推移缺乏B12(补充图7)。

讨论

明显的B12缺乏通常被发现与一系列症状有关，包括腹泻、贫血和不可逆的神经病变42,43。服用二甲双胍的患者B12缺乏的情况比其他情况更常见，可能是由于其逐渐发展而未被发现。因此，目前还没有明确的指南来治疗服用二甲双胍患者的B12缺乏症44，尽管补充B12通常是为了减轻可能产生的后果。更好地了解二甲双胍引起的B12缺乏症的机制将有助于制定诊断和治疗这种特殊类型B12缺乏症的指南。

利用模式生物大肠杆菌，我们的研究表明二甲双胍增加了环境中细菌B12的积累。通过结合蠕虫和大肠杆菌的不同筛选，我们从机制上揭示了双胍类药物在帮助细菌积累B12方面发挥作用的分子基础，即通过rda依赖的方式通过转录提高B12转运基因的表达。总之，我们的研究结果为进一步研究二甲双胍在诱导人类B12缺乏症中的作用提供了一个视角，并为开发针对此类副作用的更有针对性的干预措施奠定了基础。

二甲双胍一直被认为有利于促进长寿，并通过调节肠道细菌代谢来治疗蠕虫和人类的代谢紊乱[16,18,45]。最近的一项研究报道，二甲双胍对T2D患者肠道微生物组成和功能的变化有直接影响。他们发现，药物治疗伴随着负责细菌环境反应的基因的显著富集，比如atp结合盒转运体。其他研究小组也发现二甲双胍治疗可以改变不同细菌种类的细菌膜功能和活性46,47。有多种细菌定植于人类远端回肠48，其中大多数缺乏重新合成B12的酶，依赖于外源B1249的摄取。据报道，这些细菌通过调节B12转运体从定植宿主获得B12的能力很高50,51。在这里，我们证明了这两种双胍类化合物可以通过以rda依赖的方式增加B12转运蛋白的表达来提高多种大肠杆菌菌株中B12的积累。双胍类化合物是否能在其他种类的肠道微生物群中引起这样的影响还有待进一步的研究。

已知转录因子RcdA在介导生物膜主调控因子CsgD28和其他参与应激反应的参与者的功能中具有活性29。值得注意的是，在我们最初的筛选中，生物膜形成途径是丰富的，尽管这些基因的耗尽似乎对调节苯双胍在细菌中的生长抑制活性没有影响(图4b)，这表明生物膜形成在细菌B12聚集中的潜在作用。RcdA最近被发现与多种可能感知或响应环境信号的配体组成复合物。此外，我们的研究提出了RcdA在介导双胍诱导的细菌B12积累中的作用。大肠杆菌中B12的运输被认为主要依赖于Btu系统和能量传导的TonB复合物53。据报道，有许多方法可以调节B12转运蛋白基因，包括金属依赖性调节因子、σ/抗σ因子系统、TonB复合体上的小rna和btub54,55上的核糖开关调节。双胍类化合物是否以及如何通过这些途径，以rda依赖或独立的模式调节B12转运基因的表达，值得进一步研究。

值得一提的是，本研究提出了一种相对于长期低剂量二甲双胍治疗T2D患者的急性治疗模式，使用相对高剂量的二甲双胍。我们的研究结果表明，二甲双胍和苯双胍都可以从培养环境中显著促进细菌B12的积累，但它们是否在生理背景下提高B12的积累值得进一步研究。另外，双胍类药物诱导的b12缺陷小鼠模型，在我们目前的专业知识之外，可以在未来的研究中应用，以验证和推进我们的研究结果走向潜在的临床应用。

方法

菌株

大肠杆菌菌株OP50、HT115和HB101来源于CGC。Keio基因敲除集合(Cat# OEC4988)和亲本菌株BW25113 (Cat#OEC5042)购自Dharmacon。大肠杆菌菌株在正常LB或b12缺失培养基(用中和的大豆蛋白胨代替色氨酸，此后称为大豆培养基)中于37°C下生长。大肠杆菌缺失突变体在含有50 μg/mL卡那霉素56的正常LB或大豆培养基中于37℃培养。

秀丽隐杆线虫菌株

蠕虫按照描述在20°C57下保持。菌株VC1760 (nhr-114(gk849))和VL749 (wwIs24 [Pacdh-1::GFP + unc-119(+)])购自CGC。所有实验均采用同步雌雄同体动物进行。

化学物质

CN-Cbl (Sigma Aldrich, Cat# V900445)在15 mM的ddH2O中作为原液溶解。二甲双胍和phenformin (Sigma Aldrich, Cat# D150959和Cat# PHR157)分别作为1 M和0.2 M的原液在ddH2O中制备。根据先前的研究18,38和被试生物对药物的耐受水平，本研究中使用了不同剂量的双胍类药物。简而言之，平板上处理∆nhr-114虫用50 mM二甲双胍，所有细菌处理用200 mM二甲双胍。以相同体积的ddH2O作为对照(Veh)。所有细菌处理均采用4 mM的苯双胍饲喂Pacdh-1::GFP蠕虫，LC-MS/MS测定，生长测定和qPCR。在Keio Collection筛选中，以最佳浓度2 mM的Phenformin饲喂Δnhr-114蠕虫，以确保足够的细菌生长。用最高剂量(5 mM)的苯双胍进行平板处理或生长抑制试验，以筛选最强的苯双胍耐药菌株。所有试剂使用前用0.22 μm膜过滤，保存在- 20°C。

的生育能力评估Δnhr - 114蠕虫

大肠杆菌OP50在正常LB或大豆培养基中培养，然后在NGM或缺乏b12的NGM(蛋白胨被中和的大豆蛋白胨、氧化酶、Cat# LP0044T取代)琼脂板上播种。用指定浓度的二甲双胍和苯双胍和ddH2O作为Veh处理平板4小时，然后滴入Δnhr-114蠕虫的L1s。或者，大肠杆菌菌株在大豆培养基中以指定的处理在37°C下培养12 h。将预处理后的菌液浓缩后，在滴下L1s之前，将其播种在缺乏b12的NGM琼脂板上。在第2天对线虫的繁殖力进行了量化[58]。动物被分为可育(子宫内有卵子)和不育(没有卵子)。繁殖力比计算为

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（1）

成像的Pacdh-1:绿色荧光蛋白蠕虫

大肠杆菌菌株在大豆培养基中按指定的处理在37℃下培养12、24或48 h。浓缩处理后的菌液，接种于缺乏b12的NGM琼脂板上。将L1期的Pacdh-1::GFP虫滴在培养皿上，培养至L4期。收集标本，用含左旋咪唑(1mg /mL)的M9麻醉，装在载玻片上成像。所有图像均使用固定曝光参数的徕卡DM500显微镜拍摄。

无菌培养基

采用从其他文献59中修改的配方(Supplementary Data 2)制备了b12缺陷秀丽隐杆线虫(C. elegans Habituation and Reproduction, CeHR)培养基。L1期同步Pacdh-1::GFP蠕虫在添加指定浓度的B12的CeHR培养基中培养，在20°C的摇床上以70 rpm连续摇动。采用次氯酸盐法同步除菌。

LC-MS/MS测定B12和苯双胍

采用LC-MS/MS法测定大肠杆菌中B12和苯双胍的含量。大肠杆菌在10 mL添加1 nM CN-Cbl和4 mM苯双胍或200 mM二甲双胍的大豆培养基中培养12 h。离心收集细菌，用无菌M9缓冲液洗涤3次。细菌在450 μL ddH2O中重悬，样品在- 80°C下保存过夜。样品用液氮解冻冷冻3次，用超声仪(sonic VCX150超声仪)裂解，程序10s开10s关，冰上裂解5min。超声处理后，将样品离心20分钟，使碎片成球。将上清转移到新管中，用乙腈:甲醇:上清(67.5:22.5:10 vol/vol/vol)沉淀蛋白质。然后将样品在4°C下以最大速度离心30分钟。收集上清，冻干5 h，用50µL ddH2O重悬，LC-MS/MS检测。将B12和苯双胍的浓度与细胞总数归一化。

采用AB SCIEX QTRAP 6500+质谱仪和Exion LC系统进行LC-MS/MS分析。色谱分离采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)，温度为40°C。流动相为含有0.1%甲酸、20 mM乙酸铵(A)和甲醇(B)的水，流速为0.4 mL/min。流动相B的梯度为3% 1 min, 4 min从3%上升到60%，保持60% 1 min, 0.1 min从60%上升到95%，保持95% 1.9 min, 0.1 min从95%下降到3%，保持3% 1.9 min。每个样品的进样量为3 μL。质谱仪在正离子模式下工作，设置幕气40 psi，离子喷雾电压4.5 kV，源温度550℃，离子源气1 60 psi，离子源气2 55 psi。采用优化后的锥电压和碰撞能量进行多反应监测。

RNA提取和定量RT-PCR

RT-qPCR检测细菌基因表达情况。为了评估基因表达，将细菌接种于隔夜发酵剂中，比例为1%的3ml常规LB培养基中，接种12 h。具体来说，对于药物处理组，细菌在添加1 nM CN-Cbl和4 mM苯双胍或200 mM二甲双胍的3 mL大豆培养基中培养12 h。用RNAzol (GeneCopoeia, Cat# QP020)和细菌微球提取总RNA。用DNase去除gDNA，然后用5x Hiscript®III QRT SuperMix (Vazyme, Cat# R323-01)进行反转录。采用SYBR Green PCR试剂(Vazyme, Cat# Q711-02)在定量PCR系统(Jena Qtower 3g)上进行定量PCR。为了在不同菌株中进行比较，我们将感兴趣的基因的表达水平归一化为idnT的表达水平，而将药物治疗组的基因归一化为不受双胍类药物影响的rrsA的表达水平。所用引物的序列列在补充数据3中。

大肠杆菌删除突变体屏幕Δnhr - 114蠕虫

Keio大肠杆菌缺失收集克隆于500 μL含有0.05 nM B12、2 mM苯双胍和50 μg/mL卡那霉素的大豆培养基中，96孔深孔板培养过夜。将细菌培养液浓缩至25 μL(边缘孔为30 μL)，接种于缺乏b12的96孔板上。在每孔板上放置约30只Δnhr-114动物的同步L1，在20°C下让蠕虫发育96-120 h后进行观察。如补充资料1所示，每个孔的繁殖力表型评分从0(不育)到5(可育)。

细菌缺失菌株的基因分型

将单基因缺失菌条带化到含有50 μg/mL卡那霉素的LB板上。利用基因组和卡那霉素盒特异性引物对单个菌落进行PCR。基因组引物设计用于单个菌株，起始密码子上游100-1000个碱基起始，终止密码子下游100-1000个碱基起始。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的正确大小。本研究使用的引物序列见补充数据3。

菌落形成试验

通过比较细菌培养前后菌落形成单位(c.f.u)来评估细菌活力。实验用含有1 x 106个CFU细菌/mL的初始细菌培养物进行，该细菌从过夜培养的细菌中稀释。未经处理的样品直接来自初始培养，经苯双胍处理的样品来自经5 mM药物处理的细菌，在37℃下，220 rpm连续摇动12 h。将两种样品稀释并在LB琼脂板上划线，然后在37°C孵育12小时。计算菌落形成数，计算相对菌落密度

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(2）

细胞外DNA (eDNA)的SYBR Green染色

将BW25113单菌落接种于LB培养基中培养12 h，作为染色试验的起始剂。将这些过夜培养物放在一起，在37°C下加或不加5 mM苯双胍处理6或12小时。收集每个时间点的样品进行OD600测量，并用SYBR Green I (MCE, Cat# HY-K1004, 10,000x)染色。SYBR Green I染色后的细菌图像采用Olympus FV3000-BX63, 63x浸泡物镜采集，ImageJ软件分析。每张幻灯片取3张以上图像进行荧光定量。

细菌生长抑制试验

细菌在200 μL LB中添加5 mM苯双胍，在96孔平板上以950 rpm培养12 h。利用平板阅读器(Thermo Varioskan LUX微孔板阅读器)在600 nm波长下获得过夜细菌培养物的光密度(OD)。实验一式两份，重复两次。

互补菌株的构建

为了构建用于ΔrcdA互补的质粒，将rcdA片段扩增并连接到pUC57::amp质粒(Addgene#196258)上。生成的重组载体(pUC57::amp::rcdA)随后被转化为胜任的ΔrcdA突变体。在含有氨苄西林的LB平板上选择pUC57::amp::rcdA的互补菌株。最后对选择的互补菌株进行PCR验证，并标记为ΔrcdA::rcdA。

统计和可重复性

本研究采用GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, Inc.)软件进行统计分析。所有结果均来自至少三次生物重复。在使用秀丽隐杆线虫的实验中，每种条件下至少分析了30只线虫。对于两组之间的差异，采用unpaired Student’s t检验。对于多组间的差异，采用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey检验。采用双因素方差分析(two -way ANOVA)分析两组差异。P < 0.05为差异有统计学意义。数据以平均值±S.E.M.表示在每个图中插入有统计学意义的差异。

报告总结

有关研究设计的更多信息可在本文链接的自然组合报告摘要中获得。