介绍

驱动细胞增殖和生存的生化活动是通过区隔化在空间上组织起来的。不同类型的无膜组装体，也称为生物分子凝聚体，在细胞内共存，集中一组特定的生物分子，被认为执行专门的细胞功能1,2。特别是，在遗传信息从转录和RNA加工到翻译的过程中，发现了各种凝聚物3,4,5,6。最近的研究表明，相分离机制驱动冷凝物的形成，其成分与周围的原生质不同7,8,9。由串联相互作用域10或内在无序区(IDR)9,11介导的瞬时多价分子间相互作用网络决定了缩合物的内部组织和组成12。冷凝物被认为通过多种机制发挥作用，例如，通过增加特定酶和底物的浓度来促进生化反应13，或通过隔离相关因子来调节分子的可利用性和可及性14,15。然而，凝析油组分的集体相互作用如何产生特定功能的详细机制仍不清楚。

凝析油作为物理实体，为生物分子提供了一个局部的微环境。凝析油的物理性质，如密度、物质状态和粘度，可能会影响凝析油组分探索和相互作用的方式，这将最终影响凝析油的功能16,17,18。通常，生物分子凝聚物是由缔合聚合物组成的粘弹性网状流体。因此，根据相关的时间尺度，冷凝物可以表现为粘性液体或弹性固体20,21。不同的材料特性可能比其他材料更有效地促进某些功能。例如，固体状结构可能在基于隔离的功能模式中表现更好，但可能不是理想的反应中心。这些考虑表明，冷凝物的材料特性可能是特定细胞功能的选择，并且可能是调节机制的目标。事实上，冷凝物物质特性的异常变化与包括癌症在内的疾病状态有关17。

用纯化模型系统初步研究了凝析油形成的功能结果以及材料性质对凝析油活性的影响。最近的一项研究表明，SUMOylation酶和底物的共缩合加速了SUMOylation速率22。合成DNA凝聚物在链位移反应中也表现出类似的加速效应23。值得注意的是，后一种体系强调了反应物的扩散迁移率与反应速率之间的密切联系。凝聚物介导的区隔化也可以抑制生化反应;FMRP和CAPRIN124或弹性蛋白样多肽25的体外蛋白滴表现出翻译抑制活性。与这些纯化系统相比，探测缩合如何有助于活细胞内的特定细胞功能是一项极具挑战性的任务。相分离蛋白的结构域截断或敲低/敲出除了简单地干扰凝聚外，还可能引起复杂的细胞效应，因此确定因果关系通常是困难的26。在这方面，能够动态控制凝聚的光遗传学工具可能是一种很有前途的方法来解剖细胞内凝聚的因果效应27,28,29。

在这里，我们通过结合光遗传学技术来控制细胞内相分离和单分子mRNA成像来研究凝析物形成的功能后果。光诱导将报告mrna隔离到凝聚物中导致常驻mrna的翻译输出减少。单分子成像显示单个mRNA分子经常表现出与凝聚物的短暂相互作用。合理利用光活化组分的相行为，证明了可以精确调制凝聚态组成和材料性质。利用这种能力，我们发现固化凝聚物抑制了驻留分子的流动性，同时进一步抑制了被隔离mRNA的翻译活性。我们还证明，下游细胞活动可以通过在神经元细胞中使用凝聚物为基础的翻译抑制来调节。我们的研究结果表明，微调凝聚物的材料特性可能是正常细胞生理的重要调节机制。

结果

光活化的生物分子凝聚物可以隔离特定的mrna

为了研究生物分子缩聚如何在活细胞中产生功能，我们试图使用表征良好的光诱导相分离系统optodropt27来重建最小的合成缩聚物。研究表明，在蓝光照射下，光滴结构被激活，通过相分离形成大簇。为了赋予optodrop凝析物细胞功能，我们将串联MS2外壳蛋白(stdMCP)融合到optoFUS (Cry2-mCh-FUSN)中，以招募含有噬菌体MS2结合位点(MBS)30,31的靶mRNA物种(图1A)。我们选择使用来自FUS蛋白的IDR (1-214;FUSN)，因为与许多其他IDR不同，FUS IDR缺乏与RNA32结合的能力，同时表现出很强的自结合11,27。

图1:光活化凝聚物可以隔离特定的mrna。
figure 1

optoMCP-FUS系统原理图。optoMCP-FUS由stdMCP、Cry2PHR、mCherry和FUS的n端IDR组成。在蓝光照射下，optoMCP-FUS进行相分离，形成凝聚物，特异性地招募mbs标记的mrna。B在蓝光激活和失活期间表达optoMCP-FUS的MEF细胞的代表性共聚焦图像。细胞每隔2秒成像并激活一次。参见补充影片S1和S2。C (B)所示光活化凝聚物综合荧光强度的时间演变。D固定MEF细胞的双色荧光图像，带有mbs标记的β-actin基因，表达optoMCP-FUS(上)和optoFUS(下)。mbs标记的β-肌动蛋白mrna，用smFISH(绿色)和光活化凝聚物(洋红色)显示。箭头表示单个β-肌动蛋白mRNA分子。招募到光活化凝聚物的mrna的比例。在蓝光激活20分钟后，通过smFISH数据量化mrna在光活化凝聚物中的募集情况。n = 12个optoMCP-FUS细胞，n = 11个optoFUS细胞。数据为平均值±SD。F optoMCP-FUS表达水平与凝结物形成程度的关系。对于单个MEF细胞，在蓝光激活15分钟后，将optoMCP-FUS凝聚物的综合强度与optoMCP-FUS初始胞质强度进行对比。箭头表示单个细胞，如(G)和(H)所示。G蓝光照射后optoMCP-FUS凝聚体综合强度的时间演变。H表达optoMCP-FUS的MBS-KI细胞(上)和WT MEF细胞(下)共聚焦图像。延时共聚焦图像显示了optoMCP-FUS凝聚体之间的融合事件。J FRAP实验中optoMCP-FUS凝聚物的共聚焦图像(上)和荧光恢复曲线(下)。每隔15 s活化一次细胞，诱导相分离。白色虚线圈表示漂白区域。N = 14个细胞。数据为平均值±SD。比例尺，10 μm (B、D、H)、2 μm (D、I放大图)、1 μm (J). a.u，任意单位。面板C、E-G和J的源数据在Source data文件中提供。

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我们首先在小鼠胚胎成纤维细胞(mef)中表达optoMCP-FUS，并在其内源性β-肌动蛋白基因的3 '非翻译区(UTR)插入24个MBS环31。在蓝光照射下，我们观察到optoMCP-FUS在整个细胞中迅速形成团簇(图1B, C和补充电影S1)。当蓝光被撤回时，optoMCP-FUS团簇溶解回扩散状态(Supplementary Movie S2)。为了检验靶mrna是否按照设计招募，我们针对单个MBS茎环之间的连接体进行了单分子RNA荧光原位杂交(smRNA FISH)。事实上，我们发现大多数MBS标记的β-肌动蛋白mRNA分子(平均83%)被招募到optomp - fus凝聚物中(图1D, E)。相反，在表达缺乏MBS结合能力的optoFUS的细胞中，mRNA和凝聚物之间的共定位被完全消除(图1D, E)。与β-肌动蛋白相比，缺乏MBS的内源性GAPDH mrna仍然存在于optoMCP-FUS凝聚物之外(补充图1A和B)。因此，我们的optoMCP-FUS系统可以通过MBS茎环和MCP之间的特定相互作用来隔离目标mrna。

然后，我们详细检查了optoMCP-FUS的聚类行为。鉴于MCP和MBS之间的强结合亲和力(Kd < 1 nM)33，我们推断，在MCP表达水平相对较低的情况下，单个β-肌动蛋白mRNA分子可以被识别为不同的点，这是单一mRNA成像的典型条件34,35。事实上，在表达低浓度optoMCP-FUS的MEF细胞中，我们能够观察到optoMCP-FUS和β-actin mRNA的单个复合物(Supplementary Fig. 2A和Supplementary Movie S3)。正如预期的那样，单个β-actin mRNA复合物的扩散迁移率比optoMCP-FUS凝聚物快得多(补充图2B)。当蓝光激活时，在这些具有低水平optoMCP-FUS的细胞中未观察到群集行为(补充图2A)，这表明细胞的optoMCP-FUS浓度低于相分离的饱和浓度27。为了量化optoMCP-FUS的饱和浓度，我们检测了许多表达广泛optoMCP-FUS的细胞形成光活化凝聚物的能力。我们发现存在一个明确的浓度阈值来分离细胞群体进行聚类(图1F)。值得注意的是，由于未结合的optoMCP-FUS物种的高背景，单个mRNA-optoMCP-FUS复合物在接近或高于饱和浓度的细胞中几乎无法识别(补充图2A)。然后，我们试图探究系留mrna的存在是否会影响optoMCP-FUS的饱和浓度。这是由于早期的研究报道，IDR寡聚化降低了饱和浓度，并增强了相分离27,36。与这一观点一致的是，我们观察到，当mbs标记的mRNA作为寡聚化支架存在时，optoMCP-FUS的饱和浓度降低了约20%(图1F)。饱和浓度的降低还表现为同源mrna细胞中更强的聚类行为(图1G, H)。

在光激活过程中，optoMCP-FUS团簇通常通过相互融合而增大(图1I)，这是相分离凝聚物的典型特征。为了检测optoMCP-FUS凝聚物中的分子迁移率，我们进行了光漂白后荧光恢复(FRAP)实验。我们发现，optoMCP-FUS凝聚物具有显著程度的荧光恢复(图1J)。结合在聚变过程中观察到的形状松弛，这些数据表明optoMCP-FUS凝聚物的行为像液滴。综上所述，我们证明了使用光激活的optoMCP-FUS系统，特定的靶mrna可以被招募到相分离的细胞内凝聚物中。

活细胞mRNA成像显示optoMCP-FUS凝聚物与mRNA之间的动态相互作用

然后，我们试图探索单个mRNA分子如何与optoMCP-FUS凝聚物相互作用。我们注意到，在饱和浓度以上的高水平optoMCP-FUS表达时，细胞质中未结合的optoMCP-FUS的高背景阻止了单个mRNA分子的直接可视化(补充图2A)。为了克服这一限制，我们采用了第二种正交rna标记系统，该系统由PP7结合位点(PBS)和PP7外壳蛋白(PCP)39组成。先前的研究将PBS-PCP系统与MBS-MCP同时用于标记不同的RNA物种40。因此，我们在目标基因(GOI)的3'UTR处用12个重复的MBS和PBS茎环标记(图2A)。当与optoMCP-FUS和串联PCP与串联GFP融合(stdcpp - stdgfp)一起使用时，标记的mrna可以定位在GFP通道中，而不依赖于mCherry通道中成像的光诱导冷凝。将核定位信号(NLS)融合到stdcpp - stdgfp的n端，以降低胞质背景荧光，实现mrna的单分子成像(Supplementary Fig. 3A)41,42。

图2:活细胞单mRNA成像显示optoMCP-FUS凝聚物与靶mRNA之间的动态相互作用。
figure 2

单mRNA成像与光激活相分离正交的mRNA双标记策略示意图。在目标基因的3'UTR处插入12个重复的MBS-PBS环。即使存在高背景水平的optoMCP-FUS，单个mrna也可以通过pbs结合的stdcpp - stdgfp成像为不同的焦点。B单个mrna的延时荧光图像，用stdcpp - stdgfp和optoMCP-FUS凝聚物在MEF细胞中显示，内源性c-Fos基因用MBS-PBS标记。每隔1分钟对细胞进行成像和激活。图像是最大强度投影，并通过滚动球背景减法，漂白校正和基于头部的漂移校正进行后处理。C蓝光诱导下optoMCP-FUS凝析物中stdcpp - stdgfp集成强度的时间演变。数据为平均值(实线)±SD(阴影区)。D蓝光诱导过程中未结合mrna的归一化计数。数据为平均值(实线)±SD(阴影区)。n = 4个细胞(C, D)。E(上)optoMCP-FUS凝聚物与目标mRNA相互作用的示例图像。蓝光激活30 s后，每50 ms对MEF细胞进行成像和激活。图像是行走平均，漂白校正和漂移校正。参见补充影片S4。(下)mRNA和optoMCP-FUS凝聚物的轨迹如图所示。F单个mrna与最近的optoMCP-FUS凝聚物之间的距离被追踪到几个目标mrna。G(上)目标mRNA分子扫描optoMCP-FUS凝聚物表面的示例图像。蓝光激活30 s后，每50 ms对MEF细胞进行成像和激活。图像是行走平均，漂白校正和漂移校正。(下)在扫描过程中，mRNA的轨迹是暂时用颜色编码的。比例尺，1 μm (B, E, G)。a.u.，任意单位。面板C-G的源数据在源数据文件中提供。

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我们在MEF细胞中表达了optoMCP-FUS和stdcpp - stdgfp，将12个重复的MBS和PBS插入内源性c-Fos基因的3'UTR中(图2A)。为了捕捉单个mrna与optoMCP-FUS凝聚物之间的物理相互作用，我们特别注意选择表达合适水平的optoMCP-FUS和stdcpp - stdgfp的细胞(补充图2A);如果optoMCP-FUS表达量过低，则不会触发相分离;此外，过高水平的stdcpp - stdgfp只会增加背景荧光，阻止mRNA分子的可视化。从具有适当水平的optoMCP-FUS和stdcpp - stdgfp的细胞中，我们能够捕获目标mRNA募集到凝聚体中的动态(图2B)。在蓝光照射之前，单个mrna在GFP通道中可见，但由于游离optoMCP-FUS的高背景，在mCherry通道中未观察到点。蓝光激活触发optoMCP-FUS凝聚体的形成，报告mrna被招募到其中。我们发现mRNA的招募发生迅速，在不到5分钟的时间内达到饱和水平(图2C, D)。

为了监测报告mrna分离过程中的快速分子动力学，我们将双色荧光数据的采集速率提高到20 Hz(帧/秒)。与基于optomcp - fus成像的结果一致(补充图2A和B)， mRNA和凝聚物的运动跟踪显示，单个mRNA分子的扩散速度远快于凝聚物(补充图3B和C)，尽管由于衍射限制的分辨率，它们的表观尺寸通常看起来相似。引人注目的是，我们发现单个报告mrna与optoMCP-FUS凝聚物之间的相互作用通常是短暂的;一旦相遇，频繁观察到多个短时间(<1秒)的结合和解结合事件(图2E、F、S3D和补充视频S4)。在某些情况下，报告mRNA在松散系留时似乎扫描了optoMCP-FUS凝聚体的表面(图2G)。有趣的是，我们还观察到mrna与凝析物之间稳定关联的例子(图2F和S3E以及补充影片S5)。这些具有不同结合稳定性的异质性行为与先前的观察结果一致，并且可能归因于接触时单个mrna的不同翻译状态43。因此，尽管mRNA和凝析物之间的个体相互作用在短时间尺度上通常是短暂的和可逆的，但optoMCP-FUS分子在凝析物上的积累似乎最终稳定了这些相互作用，并在更长的时间尺度上促进了报告mRNA的封存。

将mRNA隔离到optoMCP-FUS凝聚物中会抑制翻译

接下来，我们询问了凝析物中mRNA的封存如何影响翻译活性。为了监测活细胞中的翻译活性，我们在MBS-PBS报告系统中使用tagBFP作为GOI(图3A)。我们在tagBFP的c端添加了一个不稳定结构域(DD) tag44，以加速其衰变，从而提高tagBFP信号的响应率，作为翻译活性的一个指标。在没有光活化凝聚的情况下，表达较高浓度optoMCP-FUS的细胞往往表现出较高的tagBFP水平(补充图4A和B)，这表明optoMCP-FUS与3'UTR的结合可能影响报告mRNA的稳定性45。为了研究凝析物中mRNA的隔离对翻译的影响，我们测量了蓝光激活12小时内单个U2OS报告细胞中tagBFP水平的时间变化。虽然观察到tagBFP荧光在细胞间存在很大差异，但我们发现，在蓝光激活期间，单个细胞的tagBFP强度逐渐降低(12小时内降低39%)(图3B)。相比之下，在相同的激活和成像条件下，optoFUS结构的对照实验显示tagBFP的数量没有衰减。因此，将mrna招募到凝聚物中具有抑制蛋白质翻译的功能后果。我们注意到，optoMCP-FUS凝聚不会导致应力颗粒的形成(补充图5A)或蛋白质生产的整体变化(补充图5B)。

图3:将目标mrna隔离到optoMCP-FUS凝聚物中抑制蛋白翻译。
figure 3

翻译抑制示意图，用tagBFP荧光监测，由于mRNA被隔离到光活化凝聚物中。B在蓝光激活12小时期间，使用tagBFP mRNA报告基因检测单个U2OS细胞的tagBFP荧光水平(中)。粗体曲线为平均值。(右、左)显示光激活前后的共聚焦图像。n = 32 (optoMCP-FUS)和30 (optoFUS)。细胞被滤过的DIA光激活。C光激活12 h后单个细胞的归一化tagBFP强度。荧光强度与光激活前单个细胞的初始值归一化。n = 43 (optoFUS)， 117 (optoMCP-FUS)和15(异霉素)。采用Student 's双尾t检验计算统计学显著性。**** p < 0.0001。P = 4.71E-11 (optoFUS和optoMCP-FUS)和5.38E-17 (optoFUS和大霉素)。数据为平均值±SD。D optoMCP-FUS表达水平对翻译抑制程度的影响示意图。E不同表达水平的单个细胞的optoMCP-FUS凝聚物的综合强度散点图。F光激活12 h后归一化tagBFP强度与optoMCP-FUS表达水平的关系。N = 32(0-100)， 25(100-200)， 34(200-300)， 12个(300-400)。数据为平均值±SD。比例尺，10 μm (B). a.u，任意单位。在Source data文件中提供了面板B、C、E和F的源数据。

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在optoMCP-FUS样品中观察到的翻译抑制程度不如用大霉素(一种蛋白质合成抑制剂)处理的样品(图3C)。由于在我们的optoMCP-FUS系统中，抑制是通过光诱导mrna聚集到凝聚物中实现的，我们推断翻译抑制可能敏感地依赖于optoMCP-FUS的浓度(图3D)。事实上，我们发现每个细胞中光活化凝聚物的总量强烈依赖于optoMCP-FUS的细胞质浓度(图3E)，并且更高的optoMCP-FUS浓度引起更强的翻译抑制(图3F)。这种行为也可以部分解释在群体水平上观察到的翻译抑制的高细胞间差异的起源(图3B)。

调节凝析油的材料性质会影响其功能

影响缓蚀过程的另一个因素是凝析油的材料特性。根据物质状态的不同，居住在冷凝物中的生物分子经历不同的局部环境46;在类液体状态下，它们与不断重排的邻近分子发生动态相互作用;相反，处于固体状态的生物分子往往被附近的分子所束缚，表现出局部动力学。使用我们的optoMCP-FUS凝析物作为重建的最小模型，我们试图直接探索材料状态的变化如何调节凝析物的功能(图4A)。为了控制材料性质，我们采用了调整冷凝物组成的策略，遵循三元规则溶液体系的概念47(补充图6A)。具体来说，optoFUS构建体(FUSN-miRFP670-Cry2)在optoMCP-FUS细胞中共表达，先前显示形成固体状凝胶27(补充图6B和C)。由于在这两种结构中，相同的基序介导了驱动相分离的分子间相互作用(FUSN-FUSN以及Cry2-Cry2)，我们推断共缩聚会产生两种结构中富集的凝聚物(图4A和补充图6A)，并且降低了内部动力学。

图4:含mrna凝聚物的固化强化了翻译抑制。
figure 4

A(左)不同材料性质对凝聚函数的影响示意图。(右)凝析液成分被改变以适应optoFUS，一种固体状凝胶形成的光活化成分。插图:U2OS细胞中凝胶状optoFUS簇的图像。B表达tagBFP报告基因mRNA、optoMCP-FUS和optoFUS的光激活U2OS细胞共聚焦图像示例。C蓝光激活U2OS细胞表达optoMCP-FUS和optoFUS的相图。实圆表示有冷凝物的细胞，空圆表示没有冷凝物的细胞。D(左)对于单个细胞，测量的冷凝水成分显示为不同半径的圆。(右)不同水平的optoMCP-FUS和optoFUS细胞中冷凝物的测量组成。原点附近有虚线边界的区域对应于浓度范围，在此范围内(C)没有观察到相分离。E(左)(D)中来自每个群体的细胞的代表性共聚焦图像。细胞边界用黄色曲线表示。(右)optoMCP-FUS和optoFUS沿白色虚线的强度分布图。荧光强度用optoMCP-FUS在每个凝聚物中的最大像素值归一化。F(左)蓝光激活12 h后单个细胞归一化tagBFP强度散点图。选择翻译抑制较强的一组细胞，标记为1组，进行进一步分析。选择仅表达optoFUS的第2组细胞，使其具有与第1组相似的聚集水平(补充图6F)。(右)移动平均散点图三维等高线图。G(上)FRAP实验中(F)中两个不同基团凝聚物的荧光图像。(下)各组凝析物荧光恢复曲线。数据为平均值(实线)±SD(阴影区)。n = 12(第1组)和11(第2组)。H第1组和第2组细胞光激活12 H后tagBFP强度归一化。数据为平均值±SD。n = 18(组1)、12(组2)。*P < 0.05。p = 0.0102。比例尺，10 μm (A、B)、5 μm (E)、1 μm (G)， a.u.，任意单位。在Source data文件中提供了面板(C、D和F-H)的源数据。

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在实验测试中，我们确实发现optoMCP-FUS和optoFUS的相图与三元规则溶液模型的预期相匹配(图4B和C，以及补充图6A);而不是形成两个不混相致密相，一个单一的致密相富集在两个结构构成光活化凝聚。然后我们探讨了凝析油组成是如何被调制的。为了量化凝析物的组成，我们测量了光活化凝析物的荧光强度，以确定两种构建物的广泛表达水平。由于(1)optoMCP-FUS凝析物趋向于较小，(2)小点的点强度容易被低估，我们使用optoFUS荧光与optoMCP-FUS的比例作为凝析物组成的代表(图4D)。我们发现，根据相图中的相对位置，optoMCP-FUS和optoFUS的细胞表现出不同的分子组成(图4D和E，以及补充图6D和E)，这与三元规则溶液模型的预测一致48(补充图6A)。光致凝析物在光致凝析物中富集程度相对较高，反之亦然(图4D、E和补充图6D、E)。

建立了一种系统调节凝聚物组成的方法，然后研究了不同组成对翻译抑制程度的影响。使用与单独应用于optoMCP-FUS相同的蓝光激活方案(图3B)，基于剩余的tagBFP荧光测量单个细胞的翻译抑制。我们观察到，一般来说，细胞在翻译抑制程度上表现出强烈的细胞间差异(图4F)，但有两个有趣的特征是值得注意的。首先，与单独使用optoMCP-FUS的结果一致(图3F)，较高浓度的optoMCP-FUS倾向于更强烈地抑制翻译。更重要的是，在三元相图的一个区域，凝析物组成预计偏向于高比例的optoFUS(图4F中标记为1组)，我们观察到与其他区域的细胞相比，翻译抑制更强。考虑到凝聚物中optoFUS的高掺杂率，我们推测这组凝聚物总体上可能比仅使用optoMCP-FUS的细胞更像固体。为了验证这一想法，我们量化了第1组细胞的分子迁移率和翻译抑制，然后将其与单独使用optoMCP-FUS的细胞(第2组)进行比较。在此过程中，我们选择了第2组细胞，使两组之间凝聚物的总量相似(补充图6F)。值得注意的是，我们发现，在FRAP实验中，具有高比例optoFUS的第1组凝析物确实更像固体(图4G)，并且表现出更强的翻译抑制作用(图4H)。第2组表现出更强的报告mrna招募(补充图6G和H)，进一步支持固体样材料特性是观察到的翻译抑制的关键机制。总之，使用我们的光活化凝聚物，我们找到了直接的实验证据，将凝聚材料的性质与功能联系起来。特别是，我们的研究结果表明，固化凝聚物可以抑制驻留mrna的翻译。

mRNA隔离对翻译的抑制作用在短时间内发生

虽然我们使用了不稳定结构域(DD)标签来加速蛋白质降解，但翻译报告系统的响应速度从根本上受到tagBFP的衰变速度的限制，在我们的研究中，tagBFP的衰变速度为~6 h(半衰期)(Supplementary Fig. 7)。为了研究翻译抑制是否在光激活冷凝后立即有效，我们采用了purromycyylation - pla (Puro-PLA)实验，利用近距离连接来定位在purromycin短孵育时间内新合成的特异性多肽49。在实验中，引入低浓度的嘌呤霉素来标记和释放核糖体的细长多肽链，然后由两种不同的抗体分别针对感兴趣的特定蛋白质和嘌呤霉素进行识别。

我们首先用mbs标记的β-actin mRNA在MEF细胞中表达optoMCP-FUS，然后用蓝光激活它们20分钟，诱导凝析物的形成和mRNA的分离(Supplementary Fig. 8A)。在保持蓝光激活的同时，用嘌呤霉素处理细胞5分钟，在此期间，新生多肽被引物用于Puro-PLA实验的扩增和检测。与没有任何蓝光激活的对照样品相比，我们发现冷凝导致Puro-PLA点的数量减少了28%(补充图8B和C)。因此，我们的结果表明，基于冷凝物的mRNA隔离的翻译抑制在光激活后20分钟就开始生效。值得注意的是，在光激活过程中没有观察到靶mRNA总量的变化(补充图8D和E)。这一结果进一步证实了翻译输出的减少是由于mRNA的空间再分布，即mRNA被封存成凝聚体，而不是其他过程影响了它们的丰度。

活神经元cLTP过程中内源性β-肌动蛋白mRNA翻译的扰动

然后，我们试图研究基于凝聚物的翻译抑制是否可以调节下游细胞功能。为此，我们选择探讨化学长期增强(cLTP)刺激时脊柱扩大的过程。树突棘是神经元树突上的小突起，兴奋性突触的突触后位点位于树突上。在突触刺激下，一些树突棘表现出持续超过一小时的体积增加50，这被称为结构长期增强(sLTP)51,52。这种结构可塑性高度依赖于肌动蛋白细胞骨架的动力学53,54，并与mRNA定位和蛋白质的局部翻译52,55,56相关。在这方面，我们应用我们的optoMCP-FUS系统在蓝光下短暂阻断β-肌动蛋白的翻译，并研究了这种改变的翻译对cLTP刺激下单个树突棘结构反应的影响。

我们首先在3'UTR (Actb-MBS神经元)31上标记内源性β-肌动蛋白基因的解离海马神经元中表达optoMCP-FUS，并进行了一系列光活化凝聚表征。当蓝光激活时，这些神经元表现出optoMCP-FUS的全局聚类，正如在MEF细胞中观察到的那样(图5A)。由于神经元具有高度扩展的结构，我们想知道使用optoMCP-FUS系统是否容易实现局部凝聚。当高度局部的光激活应用于神经元的亚细胞区域时，我们发现在照射区域形成了单个optoMCP-FUS簇(图5B)。然后，我们试图探测目标mrna是否被有效地隔离到神经元中光激活的optoMCP-FUS凝聚物中。smRNA FISH实验表明，内源性β-肌动蛋白mRNA被招募到神经元树突中的optoMCP-FUS凝聚物中(图5C和补充图9)。因此，我们的optoMCP-FUS系统允许通过靶向隔离神经元中特定mRNA物种来控制凝聚物的形成。

然后，我们询问光诱导β-肌动蛋白mRNA封存到凝聚物中是否会影响sLTP(图5D)。当cLTP刺激MBS-KI神经元在没有蓝光的情况下，我们发现脊柱体积随着时间的推移而增加(图5E, F)，如先前报道的56,57。然而，在蓝光激活条件下，树突棘的体积增加被明显抑制(图5E)。与黑暗条件相比，我们观察到光诱导的mRNA缩聚的平均体积增加减少了42%(图5F和G)。与脊柱生长的局部翻译要求一致，环己亚胺(CHX)处理导致sLTP的强烈抑制(图5F和G)。为了进一步测试缩聚诱导的sLTP抑制的分子特异性，我们对野生型神经元施加了相同的cLTP刺激，没有整合β-肌动蛋白基因的MBS。在蓝光存在的情况下。对照样本显示脊柱生长与黑暗条件相似(图5F和H)，表明蓝光本身不是观察到的sLTP抑制的来源。综上所述，这些结果表明，我们的光诱导凝聚系统可以在神经元中隔离特定的内源性mRNA物种，这可以调节局部细胞活动，如与突触可塑性相关的脊柱扩大。

图5:活神经元化学LTP过程中内源性β-肌动蛋白mRNA翻译的扰动。
figure 5

MBS-KI神经元共聚焦图像显示optoMCP-FUS凝聚物形成。细胞每2 s活化一次。B MBS-KI神经元局部凝聚物形成的共聚焦图像。神经元的亚细胞区域被蓝光局部激活(上)。(下)沿着一条横过optoMCP-FUS凝结水中心的水平线生成一个测速图(漂移校正)。细胞每2 s活化一次。C带有MBS标记的β-肌动蛋白基因的固定optoMCP-FUS表达神经元的双色荧光图像。黄色箭头表示β-肌动蛋白mrna和optoMCP-FUS凝聚物之间的共定位。D(左)化学长期增强(cLTP)期间脊柱增大。(右)cLTP摄动实验时间线。E在有和没有蓝光激活的cLTP过程中树突的代表性图像。黄色箭头表示增大的树突棘。F cLTP后平均脊柱体积随时间的变化。n = 174(深色)，307(浅色)，167 (WT)和128 (CHX)。数据为平均值±s.e.m。G cLTP刺激后160分钟MBS-KI神经元平均脊柱大小的定量。n = 174(深色)，307(浅色)和128 (CHX)。p = 3.52E-05(黑暗和CHX)和7.61E-04(黑暗和光明)。数据为平均值±s.e.m。H光激活条件下cLTP刺激后160 min平均脊柱大小的定量。n = 307(轻型)和167(轻型)。p = 1.77E-04。数据为平均值±s.e.m。****P < 0.0001， ***P < 0.001。比例尺，10 μm (A-C)和1 μm (E)。面板(F-H)的源数据在“源数据”文件中提供。

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讨论

我们的工作直接表明，mRNA被隔离到生物分子凝聚物中具有减少常驻mRNA翻译输出的功能后果。在不改变调控蛋白的序列或表达水平的情况下，我们使用光遗传学方法来控制工程rna结合蛋白的细胞内期，这些蛋白与目标mrna特异性相关。我们发现，在光激活后20分钟，靶mRNA的缩聚导致翻译抑制，正如Puro-PLA实验所示。与凝聚驱动行为一致，我们观察到在表达较高浓度相分离成分的细胞中有更强的抑制。有趣的是，我们发现翻译抑制的程度小于基于mRNA隔离水平的预期。正如我们在单分子跟踪实验中观察到的那样，我们将这种行为归因于单个mrna和凝聚物之间相互作用的高度瞬态性质。因此，针对凝析物的单个mrna可能经历了翻译起始/延伸和凝析物封存之间的随机竞争。进一步利用翻译活性的单分子成像(58,59,60,61)可以帮助阐明在不同细胞环境下定位于生物分子凝聚物的mrna的命运。

RNA通过参与各种RNA-蛋白和RNA-RNA相互作用，在各种凝聚物的组织中起着核心作用18,62。在功能方面，mrna的凝聚体分裂与不同的结果相关，从翻译诱导到抑制。与RNP凝聚物集中翻译抑制mRNAs64的经典观点相反，最近涉及mRNA定位和翻译活性同时成像的研究已经确定了几种含有翻译活性mRNA的凝聚物。这些所谓的翻译工厂富含特定的mrna，包括编码糖酵解酶和信号效应物的mrna。此外，在小鼠精子发生过程中，FXR1和对精子发育重要的靶mrna的液-液相分离被证明是激活蛋白质翻译必不可少的条件67。翻译起始因子如EIF4G3被招募到FXR1凝析物中促进翻译活性。相比之下，纯化的FMRP与FXR1属于相同的脆性x相关家族，相分离导致翻译抑制68。有人提出，不同的蛋白质组成和翻译后修饰的状态会影响翻译机制划分为不同的区室及其活性结果24。有趣的是，最近一项基于单分子成像的研究表明，翻译发生在胁迫颗粒中，以前被认为是翻译沉默的凝聚体，mRNA进入胁迫颗粒并不一定会引起翻译活性的变化69。因此，相分离凝析物中mRNA募集的功能效应可能是复杂的，并且代表了各个凝析物的各种生化和物理性质的复杂后果。

根据这一观点，我们的结果揭示了不同的物质状态如何影响冷凝功能。生物分子凝聚物是粘弹性网状流体，具有随时间变化的物质特性。纯化蛋白质或蛋白质和rna混合物的凝聚物的微流变特性表明，它们表现为麦克斯韦流体，弹性在短时间尺度上占主导地位，但在较长的时间尺度上，凝聚物表现出更像液体的行为20,21。分子间相互作用的强度与冷凝物中的分子迁移率以及冷凝物的热力学稳定性和粘弹性密切相关20,70。在我们的研究中，通过合理设计凝析液的组成，我们证明了凝析液的凝固增强了基于隔离的靶mrna的翻译抑制作用。这一结果表明，在我们的体系中，翻译抑制的效果依赖于凝聚物抑制常驻组分分子动力学的能力。一般来说，最佳的材料特性可能是针对特定的冷凝物功能量身定制的，正如肿瘤抑制和细菌生长所表明的那样。值得注意的是，RNA可以根据缩合物的序列或二级结构调整其物质性质72,73。因此，mRNA定位、凝聚物的物质状态和翻译活性之间是否存在有趣的相互作用，以微调单个mRNA的翻译状态，这将是令人兴奋的。

我们的光激活体系可以系统地建立细胞内凝聚体在组成和材料性质方面的复杂性，从而研究这些宏观相行为与凝聚函数之间的因果关系。例如，不同的蛋白质结构域可以融合到核心光激活模块中，以赋予所需的组合物和功能。我们预计，我们基于成分控制调整材料性能的策略可以在未来的研究中类似地适应。我们设想这种光遗传学方法不仅有助于阐明细胞内凝聚体的内部工作，而且为工程合成凝聚体提供了一个有用的平台。

方法

动物和动物研究批准

动物护理和实验程序按照首尔国立大学(SNU)机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的协议进行，许可号码为SNU-191219-1-3。野生型C57BL/6幼崽来自韩国京畿道Koatech。雄性和雌性幼崽都被牺牲进行神经元培养。

永生化小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞系的生成

胚胎日E14小鼠从安乐死的怀孕雌性中分离。去除子宫蜕膜后，将每个胚胎连同卵黄囊一起转移到PBS培养皿中。小心地取出卵黄囊，然后取出胎儿头部和暗红色组织(心脏和肝脏)。每个准备好的胎儿用PBS洗涤并转移到新的培养皿中。添加0.25%胰蛋白酶- edta (Thermo Fisher Scientific)后，用两块刀片将胎儿组织彻底切碎。培养皿在37°C和5% CO2的加湿培养箱中孵育约45分钟。经多次上下移液彻底消化后，将MEF细胞置于10 cm培养皿上，在由Dulbecco改良Eagle培养基(Gibco)、10%胎牛血清(Gibco)、10 U/mL青霉素-链霉素(Gibco)和0.5µg/ mL真菌素(Gibco)组成的生长培养基中培养。

为了使MEF细胞永活，将细胞传递到6孔板上，用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)或Fugene HD (Promega)转染编码SV40大T抗原的质粒，传代数为1或2。转染后，将细胞置于10 cm培养皿上，用30µM的D, l -萝卜硫素(Sigma)处理。选择存活细胞，在生长培养基中培养。

细胞培养

lentix 293 T (Takara, 632180)、永生化MEF和U2OS (KCLB, 30096)细胞在由Dulbecco改良Eagle培养基(GIBCO)、10%胎牛血清(GIBCO)和10 U/mL青霉素-链霉素(GIBCO)组成的生长培养基中培养，在37℃、5% CO2的加湿培养箱中培养。

初级海马神经元培养

从Actb-MBS-KI纯合子和C57BL/6野生型(Koatech)小鼠出生后第1天(P1)雌性和雄性幼崽中解剖海马。用0.25%胰蛋白酶(Gibco)在37℃下消化海马15分钟。将海马培养在含有10% FBS (Gibco)， 1倍谷氨酰胺(Gibco)， 0.1 mg/ml Primocin (Invitrogen)的FBS中，在Neurobasal A培养基(Gibco)中培养，然后在5% CO2, 37°C的培养箱中培养并镀在聚d -赖氨酸包被的共聚焦皿(SPL Life Science)上过夜，从而灭活胰蛋白酶。4 h后，加入2 ml的B27培养基(Neurobasal A medium (Gibco)，添加1 × B27 (Gibco)、1 × GlutaMAX、(Gibco)和0.1 mg/ml primocin (Invitrogen))，在B27培养基中培养神经元，直至实验结束。

构造

将stdMCP、Cry2、mCherry和FUSN(1-214)插入到基于phrr的载体中，生成stdMCP-Cry2- mch -FUSN。通过PCR扩增stdMCP (Addgene, 98916)和Cry2 (Addgene, 10,1223)对应的DNA片段(Supplementary Data 1)，并插入到phrr - sffv /mCherry/FUSN载体中。如果没有特别说明，所有片段组装都使用HiFi DNA组装主混音(NEB)进行。miRFP670-optoFUS与optoFUS (Addgene, 10,1223)相同，只是荧光蛋白从mCherry交换到miRFP670。通过PCR扩增TagBFP (Addgene, 122151)和12xMS2PP7(Addgene, 52984)，构建TagBFP- dd -12xMS2PP7构建体。通过添加引物序列，将不稳定结构域(DD)在帧内附加到TagBFP的c端。public - nls - ha - stdcpp - stdgfp是Robert Singer赠送的礼物。在神经元中表达的pHR-hSyn-stdMCP-Cry2PHR-mCherry-FUSN是用hSyn启动子代替SFFV启动子产生的。从该构建体中删除stdMCP，克隆出用于神经元FISH实验的pHR-hSyn-Cry2PHR-mCherry-FUSN。所得到的结构被完全测序，以检查不需要的产物的缺失。

慢病毒转导

将pHR转移质粒pCMV-dR8.91和pMD2共转染制备慢病毒。G(9:8:1，质量比)加入293 T lentix (Takara Bio, 63,2180)细胞中，在6孔板中培养到约70%的合流度，使用FuGENE HD转染试剂(Promega)，按照制造商的协议。每孔共送质粒3 mg，转染试剂9µL。2天后，收集含有病毒颗粒的上清，用0.45µm过滤器(Millex)过滤。上清液立即用于转导或保存在- 80°C的等分液中。在12孔板中培养永活MEF或U2OS细胞至10%-20%的合流度，加入100 - 1000ml过滤后的病毒上清。感染的细胞通常在感染后不早于72小时成像。

单分子荧光原位杂交(smFISH)

用optoMCP-FUS或optoFUS转导的永活MEF细胞，用通过452nm带通滤光片的DIA灯的蓝光激活20分钟(Edmund Optics, 86-351，)。UBC-GFP和hSyn-optoMCP-FUS或hsyn - cry2phrr - mcherry - fusn共转染的MBS-KI神经元(DIV 9-15)在DIA灯的蓝光下通过DAPI发射滤光片(Chroma, ET460/50 m)激活20分钟。蓝光激活20分钟后，将细胞用4%多聚甲醛(电子显微镜科学)固定在1倍PBS- mc缓冲液中(1倍PBS加1 mM MgCl2和0.1 mM CaCl2)，置于显微镜台上。样品在加入固定液后立即用蓝光连续激活10min。在固定液中孵育20分钟后，用PBS-MC洗涤细胞3次。然后用0.1% Triton-X (Thermo Fisher Scientific)在1x PBS-MC中渗透细胞10分钟，然后用1x PBS-MC洗涤两次，每次震荡10分钟。在与FISH探针杂交之前(补充数据1)，细胞在10%甲酰胺的2X SSC中预孵育10分钟。在37°C下，用0.067µM FISH探针在杂交缓冲液(2 mg/ml BSA (Roche, 10711454001)、10%葡聚糖硫酸酯(Sigma-Aldrich)、10%甲酰胺、25µg/ml三文鱼睾丸单链DNA (Sigma-Aldrich, D7656)、25µg/ml大肠杆菌tRNA (Roche, 109 541) in 2X SSC)中杂交至少3小时至过夜。杂交后，样品在2X SSC中用10%甲酰胺在37°C下洗涤两次，每次洗涤20分钟。然后，用2X SSC和PBS-MC摇洗细胞10分钟。DAPI染色1分钟后，PBS-MC进行两次以上的最后洗涤，每次10分钟。成像前将样品保存在PBS-MC中，温度为4°C。FISH探针被设计用于结合茎环之间的连接子序列。所有探针的序列和荧光团在补充数据1中描述。

应激颗粒免疫细胞化学实验

表达optoMCP-FUS和tagBFP-DD-12x(MBS-PBS)的U2OS细胞用452nm带通滤光(#86-351,Edmund Optics) DIA灯全局激活20分钟。应激处理采用250µM亚砷酸钠(Sigma-Aldrich, S7400)诱导氧化应激30 min。用温DPBS洗涤细胞，然后用Image-iTTM固定液(Invitrogen FB002)在室温下固定5分钟。然后用DPBS洗涤细胞两次，0.5% PBS- t (PBS中添加0.5% Triton X-100, Cayman chemical company, A35316)处理5分钟。0.1% PBS-T冲洗后，用阻断液(0.1% PBS-T和10%胎牛血清)孵育细胞;HyClone, SV30207.02)) 30分钟。接下来，细胞用小鼠单克隆抗g3bp1 (Abcam, ab56574, 1:20 00稀释)在阻断液中处理1小时，用0.1% PBS-T洗涤2次，用标记为Alexa 647的小鼠IgG特异性二抗(Invitrogen, A-32728, 1:50 00稀释)在阻断液中孵育1小时，用0.1% PBS-T洗涤2次。

OP-Puro合并

我们使用Click- iTTM OPP Alexa Fluor 647蛋白合成检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific, C10458)，并遵循制造商的说明。简单地说，用452nm带通滤光(#86-351,Edmund Optics) DIA灯全局激活U2OS细胞20分钟。细胞与20µM Click- iTTM OPP (O-propargyl-puromycin)在37℃、5% CO2加湿的显微镜室中培养30 min。在环己亚胺(CHX)对照条件下，细胞用100µg/mL CHX预处理5 min，然后用20µM OPP和100µg/mL CHX在培养基中孵育。OPP标记后，用温暖的DPBS洗涤细胞，然后用Image-iTTM固定液(Invitrogen FB002)在室温下固定5分钟。然后用DPBS洗涤细胞两次。

Puro-PLA

在加入purromycin之前，用452nm带通滤光(86-351,Edmund Optics) DIA灯全局激活永活MEF细胞20分钟。为了标记puromycin，将细胞与3µM puromycin (Tocris)在37°C, 5% CO2湿化显微镜室中培养5 min。在大霉素对照条件下，先在40µM大霉素中孵育细胞20 min，不进行蓝光激活，然后在40µM大霉素和3µM大霉素存在下进行5 min的嘌呤霉素标记。puromycin标记后，用1X PBS-MC快速清洗细胞两次，然后用4% PFA固定在1X PBS-MC中。固定和洗涤后，用0.5% Triton X-100在PBS-MC中渗透细胞15分钟，然后用PBS-MC洗涤2次。细胞用阻断缓冲液(4%山羊血清，1X PBS-MC)在37℃下孵育1小时。细胞与Anti-Puro (1:3000, EQ0001, Kerafast)和anti - β -actin (1:1000, ab8227, Abcam)在阻断缓冲液中稀释，在37°C的湿室中孵育过夜。对于接下来的滚圈扩增，我们使用了Duolink原位PLA探针抗兔Plus (DUO92002, Sigma-Aldrich)，抗小鼠Minus (DUO92004, Sigma-Aldrich)和绿色检测试剂(DUO92014, Sigma Aldrich)，按照先前研究中描述的制造商说明进行。洗涤缓冲液“A”和“B”在使用前平衡到室温。抗体孵育后，用缓冲液‘A’洗涤细胞2次，共5分钟。PLUS和MINUS PLA探针旋涡后，每个探针在Duolink Antibody dilent中稀释1:5。将PLA探针溶液涂于细胞上，细胞在37℃的预热湿室中孵育1 h。孵育后，用缓冲液‘A’洗涤细胞2次，每次5 min。5X Duolink Ligation缓冲液用高纯水1:5稀释。洗涤后，将Ligase以1:40稀释加入1X Ligation缓冲液中。将结扎液加入细胞中，细胞在37°C的预热湿室中孵育30 min。5X放大缓冲液用高纯水1:5稀释。孵育后，用缓冲液“A”洗涤细胞2次，每次5分钟。洗涤后，将聚合酶以1:80稀释加入1X扩增缓冲液中。将扩增液加入细胞中，细胞在37℃的预热湿室中孵育100 min。孵育后，用缓冲液“B”洗涤细胞两次，洗涤10分钟。用0.01X缓冲液“B”进行额外洗涤1分钟。在显微镜下对细胞进行成像。有关更详细的描述，请参阅多联PLA荧光协议(Sigma-Aldrich)。

化学LTP (cLTP)

在用lipofectamine 2000 (Invitrogen)进行cLTP实验前36-48小时，用iRFP填充剂和hSyn-optoMCP-FUSN共转染MBS-KI或野生型神经元。将6µl脂质体2000稀释于75µl OptiMEM中，室温孵育5 min。将1.5µg iRFP和1.5µg hSyn-optoMCP-FUSN质粒稀释于75µl OptiMEM中，混合均匀。将质粒溶液75µl滴入脂胺溶液中，再次移液混合。室温孵育10 min后，在共聚焦皿中心加入150µl的混合物。将DIV 18-21海马神经元置于细胞外溶液(150 mM NaCl、2 mM CaCl2、5 mM KCl、10 mM HEPES、30 mM葡萄糖、1.5µM TTX、20µM Bicuculline和6µM士的宁)中孵育40-60 min。脊髓基线图像每3分钟成像一次，共3次，刺激前9分钟。用含有200µM甘氨酸的细胞外溶液刺激神经元3分钟。刺激后，用胞外液冲洗神经元3次，每5分钟成像一次，共36次。在拍摄脊柱基线图像和3分钟的甘氨酸刺激之前，通过DAPI发射滤光片(ET460/50 m, Chroma)照射DIA灯进行蓝光激活20分钟。在基线和cLTP治疗后脊柱成像时，拍摄GFP和iRFP通道的z-stack图像。

显微镜

所有的共聚焦图像都是在尼康A1激光扫描共聚焦显微镜上使用60X油浸物镜(na1.4)拍摄的。成像室保持在37°C和5% CO2。对于活细胞成像，细胞被镀在纤维连接蛋白(Millipore Sigma)涂层的4室35毫米玻璃底培养皿(Cellvis)上，通常过夜生长。对于单细胞激活，每隔15秒用488纳米激光对细胞进行成像。对于全局激活，细胞通常使用488 nm激光或452 nm带通滤光(#86-351,Edmund Optics) DIA灯成像。对于局部激活，定义感兴趣区域(ROI)来引导蓝色激光扫描的区域。光漂白后的荧光恢复(FRAP)在激活15分钟后以15秒的间隔使用ROI进行。

永生化MEF细胞和神经元细胞的smFISH图像使用Olympus 150X油浸物镜(NA 1.45)， Olympus IX73倒置显微镜，配备两台iXon Ultra 897 EMCCD相机(Andor)， MS-2000XYZ自动平台(ASI)。在永活MEF FISH实验中，使用488 nm二极管激光(Cobolt)激发FAM FISH探针标记的β-actin mRNA和stdmcp - cry2phrr - mcherry - fusn凝聚物。两个荧光团的发射分别由LED-FITC-A-000滤光片组(Semrock)分离，并分别用两台EMCCD相机成像。为了同时检测ms2标记的β-actin mRNA、stdmcp - cry2phrr - mchry - fusn凝聚物和GAPDH mRNA，使用488 nm二极管激光(Cobolt)激发FAM FISH探针标记的β-actin mRNA。发射光经二色镜FF495-Di03-25 × 36 (Semrock)反射，通过发射滤光片FF01-525/45-25 (Semrock)。用561 nm二极管激光(Cobolt)激发stdmcp - cry2phrr - mcherry - fusn凝聚体。发射光被ET-Cy5 49006滤光片的二色性(Chroma)反射。标记GAPDH mrna的Quasar 670 FISH探针用647 nm二极管激光(Cobolt)激发，发射光通过ET-Cy5 49006二色滤光片(Chroma)和extra ET700/50 m (Chroma)带通滤光片。同样的成像装置用于神经元FISH实验，以显示类星体670 FISH探针标记的stdmcp - cry2phrr - mcherry - fusn或cry2phrr - mcherry - fusn凝聚物和ms2标记的β-肌动蛋白mrna。

使用尼康100X油浸物镜(NA 1.49)在尼康Eclipse Ti-E倒置宽视场显微镜上拍摄U2OS细胞的smFISH图像，该显微镜配备iXon Ultra 897 EMCCD相机(Andor)， x -扫描模块配备NanoDrive PiezoZ (MCL)。使用配备405 nm、488 nm、561 nm、640 nm激光(尼康)的LU-N4激光单元，激发Alexa-488 FISH探针、optoMCP-FUS凝聚物和miRFP-optoFUS凝聚物标记的mRNA。发射用C-FL-C TRITC、C-FL-C- fitc(尼康)或49009 ET - Cy5 (Chroma)滤光片过滤。

使用Olympus IX83倒置宽视场显微镜，通过stdmcp - cry2phrr - m樱桃- fusn在永活MEF细胞中对ms2标记的β-肌动蛋白mrna进行活细胞单分子成像。显微镜配备Olympus 150X油浸物镜(NA 1.45)， iXon Life 888 EMCCD相机(Andor)， TANGO 3桌面级控制器(Marzhauser)， SOLA SE白光发光二极管(Lumencor)， ET-39010滤光片组(Chroma)。Stage-top Incubator System TC(活细胞仪器)将加湿成像室的温度维持在37℃，CO2浓度维持在5%。除了使用49022-ET-Cy5.5滤光片(Chroma)成像充满iRFP的树突棘外，使用相同的装置拍摄化学LTP处理后的树突棘活细胞图像。使用488 nm二极管激光器(Cobolt)对c-FOS-12x(MBS-PBS) mRNA和optoMCP-FUS凝聚体进行正交成像，发射光通过与成像stdmcp - cry2phrr - mcherry - fusn凝聚体和FAM-FISH探针相同的滤光片组。为了跟踪活细胞中的单个mrna，在蓝光激活30秒后，MEF细胞每50 ms成像一次。由于Cry2对488nm激光高度敏感，我们非常谨慎，在成像前不要将488nm激光暴露在细胞上。

点阵图像分析

为了测量光活化凝聚体中的mCherry和/或miRFP信号，在ImageJ中使用减去背景和高斯模糊插件对图像进行模糊和背景减去。图像经过阈值分割，点的区域由ImageJ中的ROI管理器使用Analyze Particles插件设置。

活细胞单分子mRNA成像的图像分析

使用定制的MATLAB代码和荧光珠图像校正两个emccd之间的位置偏移。为了量化mRNA募集的时间演变，首先使用Bleach Correction ImageJ插件对光漂白进行校正。然后，对mCherry通道图像进行带通和阈值处理，以确定optoMCP-FUS凝聚体的边界。测量了optoMCP-FUS凝析油边界内的stdcpp - stdgfp信号，以量化凝析油中GFP的综合强度。为了在高时间分辨率下跟踪mrna和凝聚物，使用定制的MATLAB脚本对图像进行分析74。

脊柱图像分析

由ROI manager在ImageJ中设置棘的区域。ROI是手动绘制的，以包括每个XYZ方向上的棘。在减去背景之前，将原始图像除以ImageJ75中的BaSiC插件随机生成的400张图像的平场图像。然后，使用正确的3d漂移和漂白剂校正插件对漂移和光漂白的图像进行校正。为了减去图像的背景，我们使用了subtract Background插件和Auto Local Threshold插件中的Phansalkar方法。通过将z堆叠的切片相加来测量脊柱的体积。

FISH图像分析

对于永化MEF FISH实验，首先用BaSiC imageJ插件生成的各自的平场图像对两通道图像进行分割，以纠正光照不均匀。接下来，使用自定义MATLAB代码和荧光头图像校正两个emccd之间的位置偏移。利用ImageJ中的ROI管理器生成细胞质和细胞核的二值掩模。利用TrackNTrace76软件对覆盖整个细胞的z-stack图像(z-step为0.5 μm)进行亚像素分辨率的定位，确定光致凝聚物(mCherry)和mbs标记的β-actin mrna (FAM)。通过z-图像跟踪点，并将最亮的z-平面指定为点的z-位置。计算了凝聚体对与mRNA点之间的最近距离。β-actin mRNA点在距离XY方向凝析液小于330 nm(~3像素)且在两个z步内被认为是被凝析液招募的。为了量化凝聚物中招募mRNA的比例，使用了mRNA点的振幅。为此，使用ImageJ内置的高斯模糊插件对MEF smFISH样本图像进行处理，sigma(半径)为1。然后，用定位点周围81个像素(9 × 9)内的最大值减去最小像素强度，计算每个mRNA点的振幅。对于每个细胞，通过将募集的mRNA点的振幅总和除以细胞内所有mRNA点的振幅总和来计算基于振幅的mRNA募集。

神经元FISH实验采用单聚焦z平面进行分析。通过ImageJ中的ROI管理器生成树突的二值掩模，并使用TrackNTrace检测光活化凝聚物(mCherry)和mbs标记的β-actin mrna (FAM)的位置。距离小于330nm(~ 3像素)的β-actin mrna被认为被招募到凝聚体中。对于每个树突，通过将募集的β-肌动蛋白mRNA的2d -高斯拟合振幅之和除以树突中存在的所有β-肌动蛋白mRNA的2d -高斯拟合振幅之和来计算基于振幅的mRNA募集。对于U2OS FISH实验，使用定制的MATLAB脚本(从开源代码修改74)分析图像。首先，使用稀释FAM染料样品对双通道图像进行处理以纠正光照不均匀。接下来，利用MATLAB脚本对覆盖整个细胞的z-stack图像(z-step为0.5 μm)进行光活化凝聚物(mCherry)定位。使用带通滤波的FISH图像，通过将距离XY和两个z步内小于750 nm(~7像素)的局部凝聚体的mRNA信号之和除以每个细胞内所有mRNA信号的总和来量化mRNA的募集。综合mRNA点强度由单个细胞内所有定位mRNA点的像素强度之和计算。

OP-Puro图像分析

对于OP-Puro掺入试验77,78,z-stack细胞图像进行max-Z投影。细胞核检测采用nls - stdcpp - stdgfp信号。在ImageJ中分别使用Smooth和Subtract Background插件对GFP信号进行模糊和背景减去。使用Threshold插件生成二值图像，然后使用Watershed和Analyze Particles插件检测核。手动检查检测到的掩码。对于每个细胞，在所有z片上测量掩膜内的平均OPP强度，并选择最大值作为给定细胞的相应OPP强度。

纯聚乳酸图像分析

对于永活MEF Puro-PLA实验，采用TrackNTrace软件从覆盖整个细胞的z-stack图像中检测Puro-PLA点的位置，z-step为0.5 μm。每个单元的二进制掩码由ImageJ中的ROI管理器生成。对于每个细胞，计算并绘制Puro-PLA点数。

均方位移(MSD)分析

为了测量MSD，使用ImageJ插件对光漂白进行校正，然后将图像带过以去除噪声。使用定制的MATLAB脚本在亚像素分辨率下识别和跟踪斑点。扩散常数是通过将MSD的第2、3、4个数据点拟合到一条线性线上来确定的。

统计和可重复性

除图5F-H、图S2B和图S3C外，其他结果均以平均值±标准差表示，图中中线或柱为平均值，误差柱为平均值的标准误差。采用Microsoft Excel软件进行双尾Student’s t检验，分析差异的显著性。本研究中所有显微照片均为至少三次重复实验的代表性图像。

报告总结

有关研究设计的更多信息可在本文链接的自然组合报告摘要中获得。