甲基转移酶EHMT1/GLP和EHMT2/G9a对组蛋白H3K23的重新甲基化

摘要

组蛋白的表观遗传修饰在调节染色质的允许和抑制状态中起着重要的作用，但是尽管鉴定了许多组蛋白ptm及其感知的作用，但负责产生这些染色质特征的表观遗传作者尚未得到充分的表征。在这里，我们报道了典型的组蛋白H3K9甲基转移酶EHMT1/GLP和EHMT2/G9a能够催化组蛋白H3赖氨酸23 (H3K23)的甲基化。我们的数据表明，虽然这两种酶都可以将H3K23单甲基化和二甲基化，但只有EHMT1/GLP可以将H3K23三甲基化。我们还发现，EHMT1/GLP和/或EHMT2/G9a的药物抑制或基因消融导致哺乳动物细胞中H3K23甲基化降低。综上所述，本研究确定H3K23是EHMT1/GLP和EHMT2/G9a的一个新的直接甲基化靶点，并强调了这些酶对H3K23作为底物的差异活性。

背景

长期以来，组蛋白赖氨酸的翻译后修饰(PTMs)与基因表达、DNA复制、DNA损伤修复、转座子沉默和其他模板依赖性过程有关[1,2,3,4,5,6,7]。组蛋白赖氨酸甲基化是通过组蛋白甲基转移酶(HMTs)催化在单个赖氨酸上添加一个(单-)、两个(二-)或三个(三-)甲基(- ch3)来实现的[5,7,8,9]。这些不同的修饰状态通常可以促进效应蛋白的差异结合，这些效应蛋白“读取”各种修饰状态，并帮助将额外的染色质修饰复合物引导到特定的基因组区域，并帮助驱动位点特异性染色质重塑事件[10,11,12,13,14,15]。负责向组蛋白添加甲基的hmt有时能够写入不止一种修饰状态，但通常必须与其他蛋白质和hmt协同工作才能在全基因组范围内产生所有三种修饰状态[3,4,16,17,18,19,20]。

组蛋白H3是4个核心组蛋白中的1个，在其n端尾部含有几个被甲基转移酶修饰的特征良好的赖氨酸靶点，包括H3K4、H3K9、H3K27和H3K36。在这些位置检测到甲基化的真核生物中，一些甲基化事件与基因抑制有关，并促进封闭的染色质构象(H3K9me和H3K27me)，而其他H3赖氨酸的甲基化与活跃的基因转录有关，并促进开放的染色质构象(H3K4me和H3K36me)[3,4,10,16,21,22,23,24]。从纤毛虫到哺乳动物，组蛋白H3甲基化的另一个保守位点是H3K23。尽管对该残基甲基化的生物学作用知之甚少，但它们与基因抑制和维持基因组完整性有关[25,26,27,28]。虽然催化H3K23甲基化的甲基转移酶已在原生生物、线虫和植物中被发现，但这些甲基化标记的哺乳动物作者尚未报道。

在本研究中，我们报道了H3K23是常染色质组蛋白甲基转移酶1 (EHMT1/GLP)和常染色质组蛋白甲基转移酶2 (EHMT2/G9a)的新靶点。更具体地说，我们报道了EHMT1/GLP和EHMT2/G9a酶都可以催化H3K23上的单甲基化和二甲基化，但只有EHMT1/GLP可以在体外催化H3K23上的三甲基化。此外，我们发现EHMT1/GLP和/或EHMT2/G9a在蛋白质或基因水平上的扰动会导致体内H3K23甲基化降低。有趣的是，我们的体外和体内研究也显示H3K18是EHMT1/GLP和EHMT2/G9a的单甲基化、二甲基化和三甲基化的新靶点。综上所述，本研究确定了组蛋白H3赖氨酸18和23是EHMT1/GLP和EHMT2/G9a的新甲基化靶点，并鉴定了它们在H3K23上的差异活性。

结果

EHMT1/GLP和EHMT/G9a能在体外重新甲基化组蛋白H3K23

虽然在哺乳动物染色质中已经观察到H3K23甲基化，但哺乳动物的hmt催化H3K23甲基化尚未报道。然而，在其他物种中，如拟南芥、秀丽隐杆线虫和嗜热t，修饰或类似于修饰H3K9和H3K27的组蛋白甲基转移酶也被证明可以靶向H3K23[25,26,27,28]。为了筛选哪些哺乳动物hmt作用于组蛋白H3K23，我们采用了体外组蛋白甲基转移酶测定。我们选择筛选六种已知的哺乳动物H3K9甲基转移酶Suv39h1、Suv39h2、SetDB1、SetDB2、EHMT1/GLP和EHMT2/G9a的潜在H3K23甲基转移酶活性。如前所述[4,5,7,8]，重组Suv39h1、Suv39h2、SetDB1、SetDB2、EHMT1/GLP和EHMT2/G9a都能在不同程度上重新甲基化H3K9(数据未显示)。在筛选的hmt中，只有EHMT1/GLP和EHMT2/G9a对H3K23有活性。更具体地说，我们的数据表明，虽然EHMT1/GLP和EHMT2/G9a都可以将H3K23单甲基化和二甲基化，但只有EHMT1/GLP可以将H3K23三甲基化，这是通过H3K9和H3K23组蛋白修饰特异性抗体(图1A)和电子转移解离(EthD)质谱法(图1B)进行的western blotting评估的。为了验证EHMT1/GLP和EHMT2/G9a不是不加区别地靶向H3上的赖氨酸，我们通过western blotting测试了另外两个描述良好的组蛋白H3三甲基标记:H3K4me3和H3K36me3。我们的数据显示，在我们的体外HMT系统中，EHMT1/GLP或EHMT2/G9a都不会产生H3K4me3和H3K36me3，这表明这些酶确实可以区分靶标和甲基化状态(附加文件1:图S1B)。在western blotting和质谱分析中，我们还观察到不同程度的H3K27和H3K18甲基化(附加文件1:图S1A-B)。虽然EHMT1/GLP和EHMT2/G9a催化H3K27位点甲基化的能力已经有报道[36]，但我们在文献中没有找到这两种酶靶向H3K18的例子。我们的western blotting和质谱联合检测的EHMT1/GLP和EHMT2/G9a靶向甲基化位点总结见表1。综上所述，该数据确定H3K18和H3K23是EHMT1/GLP和EHMT2/G9a的新靶点。

图1

EHMT1/GLP和EHMT2/G9a能在体外重新甲基化组蛋白H3K9和H3K23。将重组组蛋白H3.1与SAM和重组EHMT1/GLP或EHMT2/G9a孵育24小时，并对这些体外HMT反应进行western blotting检测不同H3K9和H3K23甲基化状态的丰度。B质谱法验证了EHMT1/GLP或EHMT2/G9a在体外HMT分析中催化的特定甲基化状态的存在。H3K23me3在EHMT1/GLP HMT反应中的代表性光谱和H3K23me2在EHMT2/G9a反应中的代表性光谱如图b所示。请参见附加文件1:图S1，其中包含与该光谱对应的离子和质量误差表，以及在体外HMT检测中检测到的其他甲基化状态的光谱

表1 EHMT1/GLP和EHMT2/G9a体外HMT检测组蛋白H3甲基化状态

表2合成组蛋白肽的序列和供应商详细信息

UNC0642体外抑制EHMT1/GLP和EHMT2/G9a可抑制H3K23甲基化的产生

为了进一步证实EHMT1/GLP和EHMT2/G9a对H3K23的酶活性，我们评估了这些酶的抑制剂UNC0642[29,30]是否可以降低我们生化检测系统中H3K23甲基化状态的水平。UNC0642是一种竞争性抑制剂，它结合SET甲基转移酶结构域的活性位点，并阻止酶容纳肽底物，如重组组蛋白H3[29]。为了比较UNC0642抑制剂在EHMT1/GLP、EHMT2/G9a和其他含有H3K9的SET-domain hmt中的选择性，我们使用MTase-Glo活性测定法对EHMT1/GLP、EHMT2/G9a、SetDB1和Suv39h2进行了UNC0642剂量滴定。在测试的四种酶中，与DMSO对照相比，只有EHMT1/GLP和EHMT2/G9a显示出明显的剂量依赖性酶活性下降(图2A和附加文件1:图S2A)。与其他hmt (PRMT3、SETD7、SETDB1、SETD8)相比，UNC0642对EHMT1/GLP和EHMT2/G9a具有特异性，这种抑制作用与先前的研究一致[29]。使用western blot分析来评估我们体外甲基转移酶反应的产物，我们观察到重组EHMT1/GLP或EHMT2/G9a与UNC0642孵化能降低H3K9和H3K23的甲基化(图2B)。此外，我们观察到，unc0642处理的EHMT1/GLP或EHMT2/G9a反应降低了H3K18和H3K27甲基化的产生(附加文件1:图S2B和C)。这一数据表明，EHMT1/GLP和EHMT2/G9a的特定酶活性负责体外组蛋白H3K9、H3K18、H3K23和H3K27的甲基化。

图2

EHMT1/GLP和EHMT2/GLP在体外抑制H3K9和H3K23甲基化。A用EHMT1/GLP或EHMT2/G9a竞争抑制剂UNC0642进行剂量滴定，用MTase-Glo法测定抑制剂或DMSO(载体)存在下的酶活性。B重组组蛋白H3.1分别与EHMT1/GLP或EHMT2/G9a、SAM、DMSO或10 μM UNC0642孵育24 h, western blotting检测体外HMT抑制反应中H3K9和H3K23各种甲基化状态的丢失

通过UNC0642抑制EHMT1/GLP和EHMT2/G9a，导致哺乳动物细胞中H3K23甲基化的整体降低

在体内，UNC0642也被证明可以抑制EHMT1/GLP和EHMT2/G9a甲基转移酶的活性[29,30,31]。我们用10 μM UNC0642处理各种哺乳动物细胞系5天，之后收集细胞，裂解细胞，印迹检测组蛋白H3K9和H3K23的不同甲基化状态。与我们的体外研究一致，我们的数据表明，与DMSO处理的对照相比，用UNC0642处理50B11(大鼠)、HEK293(人)和MC38(小鼠)细胞系，体内至少降低了H3K9和H3K23的一种甲基化状态(图3和其他文件1:图S3A-C)。更具体地说，H3K9和H3K23的单甲基化和二甲基化大大减少，三甲基化更微妙地减少，如果有的话。有趣的是，我们还观察到赖氨酸18和赖氨酸27的甲基化水平降低，程度较小(附加文件1:图S3A-C)。结合UNC0642抑制剂已知的选择性，这一数据暗示EHMT1/GLP和EHMT2/G9a在体内催化H3K9、H3K18、H3K23和H3K27甲基化的酶活性。

图3

药物抑制EHMT1/GLP和EHMT2/G9a可降低体内H3K9和H3K23甲基化。50B11(大鼠)或HEK203(人)细胞分别用10 uM UNC0642或DMSO处理5天。处理结束后，收集细胞，对提取液进行印迹检测各组蛋白H3K9或H3K23甲基化状态，以评估这些甲基化状态在体内的变化

赖氨酸-蛋氨酸(K-to-M)突变不同程度地结合EHMT1/GLP和EHMT2/G9a，降低体内H3K9和H3K23的甲基化水平

据报道，组蛋白中某些赖氨酸-蛋氨酸(K-to-M)错义突变可以以显性负性方式破坏天然组蛋白上互补赖氨酸的甲基化[32,33,34]。虽然K-to-M突变体的甲基化抑制机制尚不清楚，但结构和生化研究表明，蛋氨酸模拟单甲基化赖氨酸，并在突变残基上隔离同源组蛋白甲基转移酶(HMT)，阻止其甲基化天然组蛋白尾巴上的赖氨酸[32,33,34]。我们采用这种K-to-M方法在体内抑制H3K23甲基化，并在体外评估这些K-to-M突变组蛋白结合EHMT1/GLP和EHMT2/G9a的能力。因此，我们采用了体外肽拉下实验，分别将重组EHMT1/GLP或EHMT2/G9a与生物素化组蛋白肽孵育，这些组蛋白肽代表未修饰的H3K9、未修饰的H3K23以及相应的生物素化K-to-M突变肽(表2)。有趣的是，我们的数据显示，尽管这两种酶都能与H3K9M肽相互作用[32,33,34]，但只有重组EHMT2/G9a，而不是EHMT1/GLP，在体外观察到与H3K23M肽相互作用(图4A)。有趣的是，我们的体外下拉数据显示EHMT1/GLP在H3K9M中比H3K9me0中更丰富，EHMT2/G9a似乎在H3K9me0和H3K9M中同样丰富，进一步表明这两种酶与组蛋白H3的相互作用存在差异。接下来，我们想知道H3K9M和H3K23M转基因是否会在体内降低H3K23的甲基化，并产生了表达野生型H3.1、H3K9M或H3K23M突变组蛋白的转基因50B11细胞。通过western blotting检测这些细胞系的全细胞提取物在H3K9和H3K23位点的单甲基化、二甲基化和三甲基化。有趣的是，我们的数据显示，在表达H3K23M的细胞中，H3K23的单甲基化和二甲基化，而不是三甲基化受到干扰。引人注目的是，我们的数据还显示，在表达H3K9M突变组蛋白的细胞中，只有二甲基化和三甲基化状态受到干扰，而单甲基化状态没有受到干扰(图4B)。为了确保H3K9M和H3K23M的作用不是细胞类型特异性的，我们在MC38细胞中设计了这组K-to-M突变体，并观察到H3K9M(而不是H3K23M)具有类似的转基因能力来干扰H3K23me3(附加文件1:图S4A)。除了H3K9M或H3K23M外，我们没有观察到K-to-M突变中H3K23甲基化的扰动(附加文件1:图S4B)。综上所述，我们的数据表明EHMT2/G9a, H3K23的单甲基化和二甲基化的作者，可以结合并在体内被H3K23M隔离，从而导致单甲基化和二甲基化的全局扰动;而赖氨酸23的二甲基和三甲基转移酶EHMT1/GLP被H3K9M隔离，导致H3K23的二甲基化和三甲基化在全球范围内减少。这些数据还表明，在体内，EHMT2/G9a可能是H3K23的主要单甲基转移酶和二甲基转移酶，而EHMT1/GLP可能是H3K23的主要三甲基化酶。

图4

H3K23M在体外与EHMT1/GLP和EHMT2/G9a的相互作用存在差异，并在体内干扰H3K9和H3K23的甲基化。将重组EHMT1/GLP或EHMT2/G9a与H3K9me0、H3K9M、H3K23me0或H3K23M肽孵育，在体外检测结合情况，并采用western blotting检测结合情况。使用western blotting分析表达上述K-to-M突变的50B11细胞的B组蛋白，以确定这些突变对体内H3K9和H3K23甲基化状态的影响

EHMT1/GLP、EHMT2/G9a或两个基因中的任何一个缺失都会导致小鼠胚胎细胞中H3K23甲基化的整体降低

为了进一步验证EHMT1/GLP和/或EHMT2/G9a对体内H3K23甲基化水平的影响，我们对EHMT1/GLP、EHMT2/G9a或这两种酶的基因缺失的小鼠胚胎干细胞进行了测试，使用western blotting分析了组蛋白H3K9和H3K23的不同甲基化状态。与我们的抑制研究一致，我们观察到EHMT1/GLP和/或EHMT2/G9A的缺失降低了H3K9和H3K23的所有甲基化状态水平(图5)。有趣的是，之前的报道[35,36]表明，EHMT1/GLP和/或EHMT2/G9A的缺失会干扰体内H3K27的甲基化水平，我们也能够观察到这一点(附加文件1:图5)。此外，我们观察到EHMT1/GLP的缺失，而不是EHMT2/G9a的缺失，降低了体内H3K18的甲基化水平(附加文件1:图S5)。综上所述，这些数据表明EHMT1/GLP和/或EHMT2/G9a可能确实有助于哺乳动物细胞中H3K23和H3K18的甲基化水平，除了它们在体内催化H3K9甲基化的作用之外。

图5

基因消融GLP、G9a或两者均可降低体内H3K9和H3K23甲基化。将小鼠胚胎干细胞GLP、G9a或两种基因敲除，并用指定的抗体对全细胞提取物进行western blotting，以评估体内H3K9和H3K23甲基化状态的变化

结论

本研究发现H3K18和H3K23是EHMT1/GLP和EHMT2/G9a新的甲基化靶点。我们还发现，虽然这两种酶都作用于H3K23，但它们在甲基化H3K23的程度上表现出不同的活性;EHMT2/G9a只能单甲基化和二甲基化H3K23，而EHMT1/GLP可以单甲基化、二甲基化和三甲基化H3K23。我们还发现，在多种哺乳动物细胞系中，通过基因和蛋白质水平的各种扰动，EHMT1/GLP和EHMT2/G9a有助于体内H3K18和H3K23的甲基化，这表明这些酶对这些新靶点的重新甲基化在体内是相关的，并且在进化上是保守的。

讨论

组蛋白H3 n端尾部特定赖氨酸残基的甲基化有助于赋予特定的染色质状态，从而调节潜在DNA序列进入核环境[3,4,5,7,8,10,16,23,37]。虽然已经确定了许多组蛋白赖氨酸甲基化位点，但在特定残基上产生单甲基化、二甲基化和三甲基化的酶的完整补充还不完全清楚。在这里，我们发现组蛋白H3K18和H3K23是甲基转移酶EHMT1/GLP和EHMT2/G9a的两个新靶点。我们发现，虽然这两种酶都可以单甲基化、二甲基化和三甲基化H3K18，但它们在H3K23上表现出不同的活性。虽然这两种酶都能催化H3K23的单甲基化和二甲基化，但只有EHMT1/GLP能在体外催化赖氨酸23的三甲基化。我们还证明EHMT1/GLP和EHMT2/G9a的药理学和遗传破坏会降低体内H3K18和H3K23的甲基化。

更广泛地说，这项工作阐明了EHMT1/GLP和EHMT2/G9a催化的组蛋白甲基化修饰的扩展目录。虽然已知这些酶在非组蛋白和组蛋白靶点上都是混杂的[17,38]，但这项工作引起了人们对多种生物学上不同的组蛋白甲基化标记可以在体内被相同的hmt催化的现象的关注[39,40]。这项工作还可以揭示涉及这些新发现的靶标在体内的组合翻译后修饰状态，并为PTM串扰机制和癌组蛋白如何影响表观基因组的变化提供新的见解[41,42]。虽然我们的EHMT1/GLP和EHMT2/G9a体外HMT系统显示存在H3K18、H3K23和H3K27组合甲基化状态，但这些状态是否存在于细胞中还有待观察;但至少我们的数据表明，在一个靶标上甲基化的存在不会阻碍EHMT1/GLP或EHMT2/G9a对邻近靶标的甲基化。由于EHMT1/GLP和EHMT2/G9a在体内主要作为异二聚体存在，而不是单独存在，正如我们的体外系统所配置的那样，因此尚不清楚这些酶在体内催化的甲基化事件是否存在共同依赖关系。

更有趣的是，体内对EHMT1/GLP和EHMT2/G9a的干扰与许多细胞过程有关，包括自噬[43]、DNA甲基化[35,44]、缺氧[45]、肿瘤抑制[46,47,48,49]、染色质重塑[20]、突触可塑性[50]等，EHMT1/GLP的纯合子缺失会导致小鼠胚胎致死[51]。此外，这两种酶近年来一直是癌症治疗的重点[44,47,49,52,53,54]。虽然这项工作没有解决H3K18和H3K23甲基化的功能作用，但这些靶点的甲基化可能有助于这些细胞过程和病理。同样值得注意的是，H3K23和H3K9共享许多含色域的解读蛋白，包括MPP8、HP1 α、HP1 β和HP1 γ[15,55]。因此，H3K9、H3K18和H3K23相互作用组的重叠程度可能超出了“书写”的范围。需要进行更广泛的研究来确定H3K18和H3K23甲基化写入器、读取器和擦除器的完整互补，并了解这些甲基化修饰运作的生物学背景。

EHMT1/GLP和EHMT2/G9a甲基转移酶正被寻求作为药物开发的靶点，特别是作为潜在的抗癌治疗药物[44,47,49,52,53,54]，包括本研究中使用的抑制剂UNC0642，以及多种其他药物，包括最近描述的EHMT2/G9a和DNA甲基转移酶DNMT1的双重抑制剂[44]。这些酶之所以成为研究目标，很大程度上是因为它们在介导H3K9甲基化方面发挥了很好的作用，H3K9甲基化是一个重要的异色标记，癌细胞经常使用它来抑制大染色质阻滞和抑制关键肿瘤抑制基因和途径的表达[19,34,40,42]。然而，基于目前的工作，评估EHMT1/GLP和EHMT2/G9a抑制剂对其他组蛋白赖氨酸甲基化修饰(包括H3K18、H3K23和H3K27)甲基化的影响将是很重要的，因为这些修饰代表了靶向修饰，在EHMT1/GLP或EHMT2/G9a抑制下，除了单独抑制H3K9甲基化外，可能会产生意想不到的后果。

总体而言，这项工作揭示了组蛋白H3K18和H3K23是甲基转移酶EHMT1/GLP和EHMT2/G9a的新的体内靶点，并证明了这两种酶在组蛋白H3K23上的差异活性。

方法

细胞培养方法

如前所述[56]，50B11细胞在培养物中生长和繁殖。简单地说，生长培养基包括:NeuroPlex无血清神经元培养基(Gemini Bioscience， #600-300)，并添加胎牛血清(10%终品，Gemini Biosciences, Cat. 100-106)、100 mM l-谷氨酸(275 μM终品，Gibco, Cat. 25030-081)、20%葡萄糖(0.2% v/v终品)和10X Gem21 NeuroPlex补充剂(1X终品，Gemini Biosciences, Cat. 400-160)。50B11细胞在37℃、5% CO2培养箱中培养，传代次数不超过5次。HEK293和MC38细胞在含有10% v/v FBS (Gemini Biosciences, Cat. 100-106)和1X Penn/Strep (Gibco, Cat. 10378-016)的1X DMEM培养基(Gibco, Cat. 11995-065)中生长，传代不超过5次。小鼠ESCs在涂有0.1% w/v明胶(Millipore-Sigma, Cat.)的tc处理板上生长。ES-006-B)， 1X DMEM培养基(Gibco, Cat. 11995-065)，含有15% v/v灭活血清替代品(ThermoFisher, Cat. 10828010)， 2-巯基乙醇(100 μM, Gibco, Cat. 31350-010)，非必需氨基酸(1X, Sigma, Cat. 1X)。M7145-100 mL)，谷氨酰胺(2 mM, Gibco, Cat. 25030-081)， 1X Penn/Strep如前所述。小鼠ESCs每1-2天传代一次，去除分化细胞，每天更换培养基。所有类型的细胞在1X DPBS (Gibco, Cat. 14190-136)中洗涤3倍，胰蛋白酶化，并在4℃下以500 rpm旋转成颗粒细胞。所有哺乳动物细胞系分别进行STR分析和支原体种间污染和支原体细菌检测。

表达突变组蛋白的转基因50B11细胞的产生

利用迭代诱变PCR构建了编码多种赖氨酸-蛋氨酸突变体的哺乳动物组蛋白H3.1的质粒。一旦sanger-sequence被验证，得到的H3.1突变DNA序列被亚克隆到慢病毒载体(pLVX-IRES-mCherry)中。为了制备含有编码突变组蛋白构建体的慢病毒，将HEK293细胞在1X DMEM(含10% FBS和1X Penn/Strep)中培养至约70%的合流度。转染HEK293细胞时，将Fugene转染试剂与400 μL完整的DMEM培养基混合，以Fugene与总DNA的3:1比例室温孵育5 min。Fugene / DMEM混合物,5μg的矢量编码突变H3.1, 3.75μg A8.9包装质粒和2.5μg VSV-G信封质粒并允许添加了孵化在室温下15分钟。由此产生的混合物加入HEK293细胞并在37℃培养3 h。90μL 1 M添加丁酸钠(最终浓度110毫克/毫升)开放的染色质和允许更有效的整合到宿主基因组。第二天，丢弃培养基，更换为Opti-MEM，不含1X Penn/Strep，孵育12-18 h。收集富集病毒的上清液，4℃保存。此过程重复3次，每次汇集病毒上清液。混合的病毒上清液用0.45 μ m过滤器过滤，去除携带的HEK293细胞。用0.5 mL病毒上清转导50B11细胞24小时。转导完成后，取出培养基，细胞孵育2天。此时，收集一小部分异质性转导细胞进行分析(附加文件1:图S4B)。剩余细胞在384孔板中按mCherry高表达和低表达进行FACS分选(每孔1个细胞)。扩增、收获菌落，在2% SDS中重悬裂解，并进行western blotting以评估FLAG表达以及各种甲基赖氨酸组蛋白修饰(图4B)。

小鼠ESCs的生成

野生型和敲除小鼠ESCs (G9a - / -， GLP - / -， G9a/GLP - / -， G9a/GLP - / -)由日本RIKEN高级科学研究所细胞记忆实验室的Yoichi Shinkai博士的实验室提供，并按照前面的描述生成[35]。通过western blotting对KO细胞进行验证。为了产生用于western blotting的全细胞裂解液，将细胞颗粒在2% (w/v)的SDS中重悬，剧烈旋转使细胞破裂，并在16000 g时旋转以澄清不溶性细胞碎片中的裂解液。将得到的富含蛋白质的上清液滗出，并使用纳米滴(A280 nm)进行定量。

体外组蛋白甲基转移酶测定

体外组蛋白甲基转移酶反应在含20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl2, 0.1 mg/mL BSA, 1 mM DTT, 20 μM s -腺苷蛋氨酸(Promega, Cat)的缓冲液中制备。V7601)， 1 μg人重组H3.1 (New England Biolabs, Cat;M2503S)和10 ng EHMT1/GLP (Active Motif, Cat. 31920)或G9a/EHMT2 (Active Motif, Cat. 31410)，并在25°C下孵育18-24小时。反应用TFA (0.012% v/v终浓度)淬火。淬火后，样品被提交进行EthD质谱分析或用于western blotting分析。为制备用于western blotting的样品，在反应中加入1X SDS样品缓冲液和1 μL BME，样品在98℃下孵育5分钟，冷却，在16%丙烯酰胺凝胶上运行，转移到PVDF膜上，印迹各种组蛋白H3甲基赖氨酸标记(印迹条件见下)。

体外组蛋白甲基转移酶抑制试验

体外组蛋白甲基转移酶反应在含20 mM Tris、pH 8.0、50 mM NaCl、1 mM EDTA、3 mM MgCl2、0.1 mg/mL BSA、1 mM DTT、10 μM UNC0642(或相应量的DMSO作为对照)、20 uM s -腺苷蛋氨酸、1 μg人重组H3.1和10 ng EHMT1/GLP或EHMT2/G9a的缓冲液中制备。这些反应在25℃下孵育18-24小时。反应用TFA (0.012% v/v终浓度)淬火。在反应中加入1X SDS样品缓冲液和1ul BME，对样品进行SDS- page分离(在16%凝胶上运行)，然后对感兴趣的组蛋白修饰进行western印迹(见印迹条件)。使用MTase-Glo试剂盒(Promega, V7601)评估hmt对SAM到SAH的酶转化。

UNC0642对GLP/G9a的体内抑制作用

将相应的哺乳动物细胞系在含有10 μM UNC0642抑制剂(Sigma Aldrich HY-13980)或相应体积的DMSO作为对照的培养基中培养5天(每天更换培养基)。所有的哺乳动物细胞系在37℃，5% CO2条件下生长。处理完成后，通过在2% SDS中重悬细胞球产生全细胞裂解物，积极涡旋使细胞破裂，在16000 g下旋转以澄清不溶性细胞碎片，并滗出富含蛋白质的上清，通过纳米滴(A280 nm)进行定量。

质谱样品制备

每5 μg重组组蛋白先用50 μl pH 8.5的20 mM碳酸氢铵溶液重悬。加入5 μL 7.5 mg/ml (DTT)还原样品，在60℃下加热1 h。冷却至室温后，用5 μL 18.5 mg/ml碘乙酰胺在室温下黑暗烷基化15 min，然后加入0.5 μg Lysyl Endopeptidase MS Grade (Wako/Fuji Osaka, Japan)，使蛋白/蛋白酶比为10:1。样品在37℃下消化过夜，然后加入10 ul 10% v/v TFA，在快速真空中蒸发至干燥，并在- 80℃保存。分析前，样品在100 μl的10 mM TEAB中重悬，并在基本条件下使用苯乙烯二乙烯基苯圆盘(Empore SDB-XC, 3m Corp.)构建的级尖进行SPE净化。由于修饰肽的极亲水性，这被发现是保留所必需的。用20 μl 100%乙腈浸湿级尖，制备2个20 μl 10 mM TEAB等分，再上载20 μl重悬液或1 μ g LysC消化蛋白。然后用10 mM TEAB溶液在75% v/v乙腈中洗脱，蒸发至干燥。

质谱分析

由于这些早期洗脱肽的显著损失，对阶段倾斜样品采取直接的柱上方法。用5 μl 2% v/v乙腈、0.1%甲酸重悬整个1 μg的色谱柱，用easyylc色谱系统(Thermo Scientific)以500 nl/min的速度将样品装在纳米色谱柱(75 μl x 20 cm，内部填充有resil - pur C18-AQ, 3 μm Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany)上。一旦整个体积被装载到色谱柱上，以300 nl/min的浅梯度进入配备电子转移解离(ETD)能力的Orbitrap Fusion Lumos质谱仪(Thermo Scientific)。样品首先在HCD模式下运行，但在搜索时没有一个甲基化肽是阳性的。在切换到EThcD后，发现甲基化肽的几个同工型存在于+4，+5和+6电荷状态，在大部分未修饰肽之前洗脱。由于赖氨酸的甲基化产生了LysC酶的缺失切割，因此发现在不同排列的相同肽的K18, K23和K27处甲基化。K27和K18的三甲基化很容易检测到，但H3K23的三甲基赖氨酸在前几次试验中没有发现。此时，Skyline (University of Washington)创建了一个排列质量电荷列表，该列表由+4、+5或+6中含有H3K23三甲基化的所有肽组成，并将该列表作为纳入列表导入仪器获取参数中，赋予预期肽优先于任何其他m/z。最后的获取方法以60分钟的梯度运行，前体的分辨率为120,000，碎片离子的分辨率为60,000。仪器采用ETD模式运行，补充碰撞能量为20 (EThcD)。由于占空比不是目标运行的问题，因此将AGC目标和最大注入时间分别设置为1000，从而获得对内含物质量的最大灵敏度。

质谱数据分析

通过Proteome Discoverer 2.5版本，使用Mascot 2.8.0版本搜索引擎对UniProt 5640智人数据库进行质谱数据检索。以LysC为酶，EThcD为仪器类型，将搜索参数设置为包括多达5个缺失的裂解。前体的质量容差设置为5ppm，碎片的质量容差设置为20ppm，尽管后来所有结结性光谱的质量容差被过滤为2ppm。除对蛋氨酸进行氧化处理、对天冬酰胺和谷氨酰胺进行脱酰胺处理外，还进行了甲基K、二甲基K和三甲基K的动态修饰。氨基甲酰化被设定为静态修饰。使用目标-诱饵验证在1% FDR级别过滤数据库命中。

体外肽拉降

将25 μL M280链亲和素偶联的Dynabeads (Invitrogen, Cat.)# 11205D)用1X PBS-T (0.1% Triton-X 100)洗涤3次，用500 μL 1X PBS-T重悬。加入表2所示生物素化肽1 μg，室温孵育1 h。肽偶联后，用1X PBS-T洗涤肽偶联珠三次以取代任何未偶联的肽。洗涤后，将2 μg重组表达的EHMT2/G9a (Active Motif 31410)或5 μg重组表达的EHMT1/GLP (Active Motif 31920)与肽偶联的dynabeads在4℃下轻度搅拌孵育过夜。孵育后，用含有300 mM KCl, 0.2% v/v Triton-X 100, 1 mM PMSF的缓冲液洗涤5次。在第五次洗涤时，更换含有珠子的试管，以消除试管两侧残留的任何污染蛋白质。换管后，进行了第六次清洗。最后一次洗涤后，将微球重悬于1X SDS上样缓冲液中，煮沸后进行SDS- page分析。使用1:10 000抗flag抗体(Sigma F1804)对标记为flag的EHMT2/G9a进行印迹，然后进行1:10 000抗小鼠二次孵育(GE Healthcare, NA9310)。gst标记的EHMT1/GLP采用抗gst抗体1:10 000 (GE Healthcare, 27457701)进行印迹，随后兔抗山羊HRP二次孵育(Invitrogen, A27014)。使用链亲和素- hrp偶联物(Sigma， #RABHRP3, 1:10 000，室温1小时)对生物素化肽进行印迹。使用Acura生物系统成像仪对所有免疫印迹进行成像。

ELISA抗体验证

表2中列出的组蛋白甲基赖氨酸肽，在高结合，疏水性96孔板(Sigma， #M9410)中连续稀释，并允许37℃，100 rpm孵育过夜。次日，用1X PBS洗涤2次，用含4% BSA的1X PBS阻断2小时，37℃。封片后，用含0.15% Tween-20的1X PBS洗涤两次。所有抗体在1X PBS(含4% BSA和0.15% v/v Tween-20)中稀释1:10 000，加入板中，在37℃孵育2小时。肽竞争反应在室温下与相应抗体预孵育2小时，然后加入ELISA板。一抗孵育后，用含有0.15% v/v Tween-20的1X PBS洗涤3次，与二抗(1:10 000)在37℃孵育2小时。二抗孵育后，用含有0.15% v/v吐温-20的1X PBS洗涤3次。然后用含有磷酸二钠(20 mM)、柠檬酸(10 mM)和新鲜过氧化氢(终浓度:0.0012%)的缓冲液孵育板，室温下暗处孵育30 min。用1 M H2SO4淬灭反应，用492 nm谱仪成像。所有数据见附加文件1:图S6。

体外HMT和体内抑制试验的Western blotting条件

• Anti-H3K9me1;Abcam 8896;1:5,000

• Anti-H3K9me2;Active motif 39753;1:5000

• Anti-H3K9me3;Abcam 8898;1:5000

• Anti-H3K18me1;Diagenode C15410290;1:500

• Anti-H3K18me2;Diagenode C15410291;1:500

• Anti-H3K18me3;Diagenode C15410292;1:500

• Anti-H3K23me1;Active motif 39387;1:10 000(体内1:500)

• Anti-H3K23me2;Abcam 214654;1:2000

• Anti-H3K23me3;Active motif 61499;1:500

• Anti-H3K27me1;Active motif 61015;1:500

• Anti-H3K27me2;Active motif 61435;1:1000

• Anti-H3K27me3; Millipore-Sigma 07-449; 1:5000

• Anti-EHMT1/GLP; Abcam ab41969; 1:500

• Anti-EHMT2/GLP; Abcam ab185050; 1:500

• Anti-Actin;Thermo Fisher MA1-91399;1:2000

• Anti-H3;Abcam ab1791;1:5000

• Anti-GST;GE医疗，27457701;1:10,000

• Anti-Flag;Sigma Aldrich F1804;1:10,000。