国际出版号:1945-4589
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研究论文 第14卷，第21期 8645 - 8660页

去泛素化酶USP7是一种新的细胞周期蛋白F相互作用蛋白，可调节细胞周期蛋白F的稳定性

萨维莎·s·夏尔马1，2， ， W.杰克·普莱杰3， ， Paturu Kondaiah1，2， ，

  • 1印度科学研究所分子繁殖、发育与遗传学系，班加罗尔560012
  • 2 Sri Shankara癌症医院和研究中心，印度班加罗尔，560004
  • 3犹他卫生大学外科，亨茨曼癌症研究所，盐湖城，UT 84132

收稿日期:2022年10月13日      录用日期:2022年10月31日      发布日期:2022年11月5日     

https://doi.org/10.18632/aging.204372
如何引用

版权所有:©2022 Sharma et al。这是一篇在知识共享署名许可(CC BY 3.0)条款下发布的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是要注明原作者和来源。

摘要

细胞周期蛋白F，不像规范的和转录的细胞周期蛋白，不结合或激活任何细胞周期蛋白依赖的激酶。相反，它含有一个F-box基序，主要作为Skp1-Cul1-F-box E3泛素连接酶复合物SCFCyclin F的底物识别亚基。通过靶向泛素介导的蛋白酶体降解的特定蛋白，cyclin F在中心体复制、DNA复制和修复的调控以及基因组稳定性的维持中起着关键作用。细胞周期蛋白F的丰度和活性在整个细胞周期中受到严格调控。然而，调控细胞周期蛋白F的分子机制尚不清楚。在这里，我们发现去泛素化酶USP7是一种新的细胞周期蛋白f相互作用蛋白。我们观察到USP7稳定了细胞周期蛋白F蛋白，并且这种功能独立于USP7的去泛素酶活性。此外，我们的数据表明USP7也参与了cyclin fmrna的调控。药理抑制USP7去泛素酶活性导致细胞周期蛋白fmrna下调。

介绍

细胞周期的有序进展是由周期蛋白依赖性激酶(CDKs)活性的周期性振荡驱动的[1]。反过来，CDKs的活性是由它们与被称为细胞周期蛋白的变构调节蛋白的结合来控制的。cyclin家族至少有30个成员;虽然其中许多都参与细胞周期控制的各个方面，但并非所有的都是CDK激活剂[2]。在细胞周期进程中起关键作用的细胞周期蛋白中，cyclin f与cyclin a在氨基酸序列和细胞周期中表达的循环模式上最为相似[3]。然而，与cyclin A和许多其他细胞周期蛋白不同，cyclin F不结合或激活CDKs[3]。相反，cyclin F是F-box蛋白家族的创始成员，其69个成员共享一个保守的F-box结构域[4]。cyclin F利用其F-box与Skp1相互作用，Skp1同时招募Cul1(以及RBX1与Cul1):它们一起组装成一个功能性的SCFCyclin F (Skp1-Cul1-F box) E3泛素连接酶复合物[4,5]。在这个复合体中，细胞周期蛋白F作为底物识别亚基，针对特定蛋白进行泛素化和随后的降解[5]。

目前已鉴定的cyclin F底物有CP110、NuSAP1、RRM2、CDC6、SLBP、RBPJ、激活剂E2Fs和E2F7[6-13]。此外，还发现了调节cyclin F功能或自身受cyclin F调节的其他相互作用伙伴;其中包括b-Myb、p27Kip1、Akt、酪蛋白激酶II、β-TrCP和VCP[14-18]。细胞周期蛋白F与这些底物和相互作用伙伴相互作用，主要调节基因组和染色体的稳定性。值得注意的是，周期蛋白F的实验耗尽会导致多种有害后果:中心体过度复制和微核(通过稳定中心体蛋白CP110) [6,15]， dNTP池不平衡和突变率增加(由于核糖核苷酸还原酶家族成员2的积累;RRM2)[8]，未能维持电离辐射诱导的g2期阻滞和过早进入有丝分裂(通过增强细胞周期蛋白A2-CDK2−介导的b-Myb磷酸化)[14]，DNA再复制(由于CDC6的积累)[9]，H2A的持续增加。DNA损伤后的X水平和信号传导(由于SLBP的稳定)[10]，以及e2f靶基因的表达增强，并结合加速G1/S转变(由于激活剂e2f的稳定)[12]。同样，在肌萎缩性侧索硬化症和额颞叶痴呆患者中观察到的细胞周期蛋白F突变导致靶蛋白异常泛素化和积累，包括RRM2和TDP-43[19]。

考虑到细胞周期蛋白F在维持蛋白质稳态和基因组完整性方面的作用，细胞周期蛋白F很可能是一种受到严格调控的蛋白质。然而，调控周期蛋白F的机制尚不清楚。如前所述，细胞周期蛋白F的mRNA和蛋白水平在整个细胞周期中振荡[3]。细胞周期蛋白F的蛋白水平在S期开始积累，在G2期达到峰值，在有丝分裂和G1期检测不到[3]。此外，cyclin F是一种寿命短的蛋白，半衰期不到1小时[3,20]。虽然最初认为细胞周期蛋白F经历了金属蛋白酶介导的蛋白水解[20]，但最近的证据表明，它也是多种E3泛素连接酶的蛋白酶体降解靶标:G1期的APC/CCdh1, M期的SCFβTrCP，以及一种尚未确定的atr依赖性E3泛素连接酶，用于响应DNA损伤[8,18,21]。

在这项研究中，我们发现去泛素化酶USP7是一种新的细胞周期蛋白f相互作用蛋白。我们证明了USP7稳定了细胞周期蛋白F蛋白，并且这种功能独立于USP7的去泛素酶活性。此外，我们的数据表明USP7也参与了cyclin fmrna的调控。

结果

Cyclin F与USP7相关

为了发现新的细胞周期蛋白F相互作用蛋白，我们之前使用了质谱法，并从短暂表达Flag-HA-Cyclin F或空载体的U2OS人骨肉瘤细胞系的提取物中鉴定了抗ha免疫沉淀中存在的蛋白(补充文件1和补充信息)。这些蛋白包括已知的细胞周期蛋白F相互作用蛋白(例如，RRM2、CDC6和酪蛋白激酶II)，还包括USP7(泛素特异性蛋白酶7)，其与细胞周期蛋白F的关联此前未被报道。USP7是一种去泛素化酶，是维持基因组完整性的途径的主要调节剂:其中一种功能是它对MDM2-p53轴的调节[22]。为了验证cyclin F和USP7之间的相互作用，我们首先在HEK-293T细胞中短暂表达Flag-HA-Cyclin F。异位细胞周期蛋白F与抗HA标签的抗体免疫沉淀，导致内源性USP7共沉淀(图1A)。正常小鼠IgG不与Flag-HA-Cyclin F或USP7共沉淀(图1A)。这些结果表明cyclin F特异性地与USP7相互作用。cyclin F的cyclin-box已被证明介导与许多底物的相互作用(图1B)。为了检验细胞周期蛋白盒是否介导了它与USP7的相互作用，我们使用了截断突变体Flag-HA-Cyclin F1-270(缺少细胞周期蛋白盒和PEST区域;图1 b)。与野生型Flag-HA-Cyclin F一样，Flag-HA-Cyclin F1-270仍然能够共沉淀内源性USP7，这表明cyclin F与USP7的相互作用不依赖于cyclin F的cyclin-box或PEST区域(图1C)。此外，在本实验中，USP7与瞬时表达的Flag-HA-Cyclin F共沉淀，而UBR5 (E3泛素连接酶)则没有(图1C)。

Cyclin F interacts with USP7. (A) HEK-293T cells transfected with Flag-HA-Cyclin F were lysed and immunoprecipitated with anti-HA antibody or non-specific mouse immunoglobulin (IgG) as loading control. Immunocomplexes were immunoblotted as indicated. (B) Schematic representation of cyclin F WT and cyclin F1-270 truncated mutant, highlighting the F-box, cyclin-box and PEST regions. (C) HEK-293T cells transfected with Flag-HA-Cyclin F WT or Flag-HA-Cyclin F1-270 were immunoprecipitated and immunoblotted as indicated. (D) Endogenous USP7 was immunoprecipitated from HEK-293T cell extracts, with anti-USP7 antibody or an unrelated, anti-p-TAK1 antibody as a loading control (denoted as control). Immunocomplexes were immunoblotted as indicated. Asterisk denotes non-specific band.

图1所示。Cyclin F与USP7相互作用。(A)将转染Flag-HA-Cyclin F的HEK-293T细胞裂解，用抗ha抗体或非特异性小鼠免疫球蛋白(IgG)作为负载对照进行免疫沉淀。按照指示对免疫复合物进行免疫印迹。(B) cyclin F WT和cyclin F1-270截断突变体示意图，突出显示了F-box、cyclin-box和PEST区域。(C)转染Flag-HA-Cyclin F WT或Flag-HA-Cyclin F1-270的HEK-293T细胞进行免疫沉淀和免疫印迹。(D)从HEK-293T细胞提取物中免疫沉淀内源性USP7，以抗USP7抗体或不相关的抗p- tak1抗体作为负载对照(记为对照)。按照指示对免疫复合物进行免疫印迹。星号表示非特定波段。

接下来，我们评估内源性细胞周期蛋白F是否与内源性USP7相互作用。由于市售的cyclin F抗体不适合免疫沉淀，我们选择用内源性USP7代替免疫沉淀，并检查cyclin F的共沉淀。在HEK-293T细胞中，在USP7免疫沉淀中检测到cyclin F，这表明内源性cyclin F与内源性USP7相互作用(图1D)。重要的是，不相关抗体(anti-p-TAK1)的模拟免疫沉淀没有明显检测到USP7或cyclin F(图1D)。

自洽场细胞周期蛋白F不调节USP7蛋白水平

SCFCyclin F是一个泛素连接酶，而USP7是一个去泛素化酶。为了测试SCFCyclin F是否靶向USP7泛素化并随后降解，我们首先用NAE (nedd8激活酶)抑制剂MLN4924抑制所有SCF连接酶;后者的活性是SCF连接酶活性所必需的[23]。我们发现，与dmso处理的对照相比，MNL4924处理的细胞周期蛋白F水平增加(图2A)，这表明细胞周期蛋白F可能受到自催化机制或不同的F-box蛋白的调节。此外，在mnl4924处理的细胞中，我们观察到抗cyclin F抗体特异性检测到迁移较慢的条带(图2A, lane 2);我们推测这是磷酸化的细胞周期蛋白F，在没有细胞周期蛋白F泛素化的情况下，与非磷酸化形式一起积累[16]。另一方面，MLN4924处理增加了RRM2，一种有充分证据的细胞周期蛋白F底物，但不影响USP7蛋白水平，这表明SCF连接酶，包括SCFCyclin F，不调节USP7蛋白丰度(图2A)。

SCFCyclin F does not regulate USP7 protein levels. (A) HCT116 cells treated with either DMSO or MLN4924 (3 μM) for 5 h were lysed, and immunoblotted as indicated. β-Actin was the loading control. Asterisk denotes non-specific band. (B) HEK-293T cells were transfected with an empty vector or Flag-HA-Cyclin F for 48 h, lysed, and immunoblotted as indicated. (C) HeLa cells treated with DMSO, etoposide (10 μM) or MG132 (10 μM) for 4 h were lysed, and immunoblotted as indicated. Asterisk denotes non-specific band.

图2。SCFCyclin F不调节USP7蛋白水平。(A)分别用DMSO或MLN4924 (3 μM)处理HCT116细胞5 h后裂解，按图示进行免疫印迹。β-肌动蛋白为加载对照。星号表示非特定波段。(B)用空载体或Flag-HA-Cyclin F转染HEK-293T细胞48小时，裂解，并按指示进行免疫印迹。(C)用DMSO、依托泊苷(10 μM)或MG132 (10 μM)处理4 h后，对HeLa细胞进行裂解，按提示进行免疫印迹。星号表示非特定波段。

在多种细胞系中，cyclin F过表达已被证明通过泛素介导的蛋白酶体降解下调其许多底物，包括CP110和RRM2[6,8]。与这些报道的发现一致，HEK-293T细胞中cyclin F的过表达导致RRM2水平下降，但不影响USP7水平(图2B)，表明SCFCyclin F不调节USP7。

此外，我们询问其他已知降低或增加细胞周期蛋白F水平的治疗是否会干扰USP7蛋白水平。与之前的报道一致，我们发现细胞周期蛋白F在dna损伤剂依托泊苷治疗后下调(图2C)。这种效应是cyclin F特有的，因为与cyclin F具有最高氨基酸序列相似性的cyclin A2保持不变(图2C)。相反，用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞会导致迁移较慢的周期蛋白F带的形成(图2C)。这种迁移速度较慢的物种可以解释为泛素化的细胞周期蛋白F;或者，它可能代表细胞周期蛋白F的磷酸化形式。值得注意的是，SCFβ-TrCP已被证明在酪蛋白激酶II磷酸化后，靶向细胞周期蛋白F进行泛素介导的降解[18]。因此，迁移较慢的cyclin F带可能是cyclin F的磷酸化形式，由于MG132处理后其降解受到抑制而积累。p21是一种短寿命蛋白，其稳定性也受泛素化途径的调节，在MG132处理下也上调，这表明我们的实验中使用了有效浓度的MG132(图2C)。重要的是，用依托泊苷或MG132治疗不影响USP7水平(图2C)。总的来说，这些数据表明SCFCyclin F不调节USP7蛋白水平。

细胞周期蛋白F蛋白和mRNA在P22077处理下下调

接下来，我们试图评估USP7的去泛素酶活性是否有助于调节细胞周期蛋白F蛋白水平。我们使用了体内主要抑制USP7的小分子抑制剂P22077[24]。P22077通过选择性地与催化区域活性位点内的关键Cys223形成共价键，不可逆地抑制USP7[25]。在非应激细胞中，USP7对于MDM2的稳定性是必需的，MDM2是一种E3泛素连接酶，负责使p53泛素化并靶向其进行蛋白酶体降解[22,26]。在usp7缺失的细胞中，自泛素化mdm2变得不稳定，导致p53稳定[27]。因此，我们在实验中首先通过评估p22077处理细胞中的p53水平来证实USP7的抑制作用。P22077处理的HCT116细胞显示p53水平上调，表明USP7抑制(图3B)。我们没有评估p22077处理的HeLa细胞中的p53水平，其中p53被病毒e6依赖性泛素化优先降解[22]。用P22077处理HeLa和HCT116细胞可导致大约。与dmso处理的对照组相比，早在2小时，细胞周期蛋白F水平就降低了70%(图3A, 3B)。另一方面，cyclin A2未受P22077处理的干扰(图3A, 3B)。这些后一项观察结果表明，P22077在4小时的处理时间内不会引起细胞周期的明显变化，并且观察到的周期蛋白F的减少可能是USP7抑制的结果。同样，USP7水平不受P22077处理的影响(图3A, 3B)。这些数据表明USP7的去泛素酶活性特异性地在调节细胞周期蛋白F水平中起作用。同样，FT671(一种USP7的高度特异性抑制剂，与P22077结构无关)处理HCT116细胞也导致了大约。与dmso处理的对照组相比，细胞周期蛋白F水平降低了70%(补充图1)[28]。

USP7 regulates cyclin F protein levels. (A) HeLa cells treated with DMSO, MLN4924 (10 μM), or P22077 (25 μM) for the indicated hours were lysed, and immunoblotted as indicated. β-Actin was the loading control. Asterisks denote non-specific bands. Fold changes were calculated with densitometric values for cyclin F and cyclin A2 blots using β-Actin as loading control. (B) HCT116 cells were treated with DMSO or P22077 (25 μM) for 5 h. Where indicated, cells were treated with MG132 (10 μM) for 4 h prior to harvest. Cells were then lysed and immunoblotted as indicated. Asterisks denote non-specific bands. Fold changes were calculated with densitometric values for cyclin F and cyclin A2 blots using β-Actin as loading control. (C) HCT116 cells were treated with DMSO or cycloheximide (CHX; 50 μg/mL) for 75 min. Where indicated, bafilomycin A1 (BafA1; 100 nM) and/or MG132 (12.5 μM) were added along with CHX. Cells were lysed, and immunoblotted as indicated. Asterisks denote non-specific bands.

图3。USP7调节细胞周期蛋白F的水平。(A)用DMSO、MLN4924 (10 μM)或P22077 (25 μM)处理指定时间的HeLa细胞裂解，按指定时间进行免疫印迹。β-肌动蛋白为加载对照。星号表示非特定波段。以β-Actin作为加载对照，用密度计值计算细胞周期蛋白F和细胞周期蛋白A2印迹的折叠变化。(B) HCT116细胞用DMSO或P22077 (25 μM)处理5小时。如有说明，细胞在收获前用MG132 (10 μM)处理4小时。然后按指示裂解细胞并进行免疫印迹。星号表示非特定波段。以β-Actin作为加载对照，用密度计值计算细胞周期蛋白F和细胞周期蛋白A2印迹的折叠变化。(C) DMSO或环己亚胺(CHX)处理HCT116细胞;50 μg/mL)注射75 min。如有指示，巴菲霉素A1 (BafA1;100 nM)和/或MG132 (12.5 μM)与CHX一起加入。细胞裂解，按指示进行免疫印迹。星号表示非特定波段。

接下来，我们询问MG132对蛋白酶体的抑制是否会挽救p22077介导的细胞周期蛋白F的下调。与dmso处理的对照组相比，MG132单独处理导致细胞周期蛋白F弥漫性迁移较慢的条带的积累，这表明泛素化的细胞周期蛋白F的积累是蛋白酶体抑制的结果(图3B)。MG132治疗不能挽救p22077介导的细胞周期蛋白F的减少(图3B)。这一观察结果促使我们研究两种可能的情况:首先，我们确定细胞周期蛋白F是否确实像其他人报道的那样被泛素-蛋白酶体系统降解。我们使用环己亚胺检测了在存在或不存在一对抑制剂的情况下cyclin F的稳定性，即MG132或巴菲霉素A1(液泡型H(+)- atp酶的抑制剂，因此是溶酶体中蛋白质降解的抑制剂)[29]。当环己亚胺抑制新生蛋白合成时，与对照组相比，Cyclin F水平显著降低至50%以下(图3C)。只有当细胞与MG132共处理时，这种减少才得以恢复，而不是巴菲霉素A1，这表明细胞周期蛋白F确实是蛋白酶体系统降解的目标，而不是溶酶体降解的目标(图3C)。LC3B-II在溶酶体中被降解，LC3B-II的积累表明，在使用巴菲霉素A1的浓度下，溶酶体酶被有效抑制(图3C)[30]。其次，我们检查了p22077诱导的细胞周期蛋白F蛋白水平的降低是否由于细胞周期蛋白F mRNA水平的降低。我们对DMSO或P22077处理1和4小时的HeLa细胞进行了逆转录- pcr分析。虽然1小时时，对照组和P22077处理的细胞之间的细胞周期蛋白F mRNA水平没有明显差异，但P22077处理4小时时，细胞周期蛋白F mRNA水平下降了近50%(图4A)。这些结果表明USP7调节细胞周期蛋白fmrna水平，这种调节依赖于它的去泛素化酶活性。在HCT116细胞中也观察到类似的效果(图4B)。

USP7 regulates cyclin F mRNA levels. (A) HeLa cells treated with DMSO or P22077 (25 μM) for the indicated hours were collected and total RNA was extracted. cDNAs prepared from each sample were amplified using primer pairs specific to each gene as indicated. The PCR products were analyzed by agarose gel electrophoresis and stained using ethidium bromide. RPL35A was the loading control. Fold change in cyclin F:RPL35A ratios were determined using densitometry values of the amplicons. The values represent an average from two independent experiments. (B) HCT116 cells treated with DMSO or P22077 (25 μM) for 4 h were analyzed as in (A).

图4。USP7调节细胞周期蛋白fmrna水平。(A)收集DMSO或P22077 (25 μM)处理指定时间的HeLa细胞，提取总RNA。从每个样品中制备的cdna使用特定于每个基因的引物对扩增，如所示。PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析，溴化乙啶染色。RPL35A是装载控制。利用扩增子的密度测定值确定cyclin F:RPL35A比率的倍数变化。这些值代表两个独立实验的平均值。(B)用DMSO或P22077 (25 μM)处理4 h的HCT116细胞分析见(A)。

USP7调节细胞周期蛋白F的稳定性

接下来，我们研究了USP7是否调节cyclin F蛋白的稳定性。在存在或不存在Flag-USP7-WT的情况下，用Flag-HA-cyclin F转染HCT116细胞。如图5A所示，USP7过表达增加了cyclin F的半衰期(~ 60分钟)，而模拟转染细胞的cyclin F的半衰期约为30分钟。接下来，我们评估了这种稳定性是否依赖于USP7的去泛素酶活性。我们采用了两种方法:第一种方法涉及P22077对USP7活性的药理学抑制，第二种方法涉及USP7催化缺陷突变体的表达。当环己亚胺抑制新生蛋白合成时，异位细胞周期蛋白F水平显著降低至对照水平的50%以下。这种减少在过表达野生型Flag-USP7的细胞中被恢复(图5B, 5C)，无论P22077是否抑制USP7(图5B;最后一个车道)。这些数据表明，USP7诱导的细胞周期蛋白F的稳定性与USP7的去泛素酶活性无关。这一发现在USP7的催化突变体Flag-USP7-CS的实验中得到了进一步的证实，该突变体在催化结构域中包含了一个关键的Cys223到Ser的突变。如图5C所示，环己亚胺诱导的cyclin F水平的降低在过表达Flag-USP7-CS的细胞中被有效地恢复，与过表达Flag-USP7-WT的细胞相似。

USP7 regulates cyclin F protein stability. (A) HCT116 cells were co-transfected with Flag-HA-Cyclin F WT and Flag-USP7 WT or empty vector. Twenty-four hours post transfection, cells were treated with DMSO or cycloheximide (CHX; 50 μg/mL) for the indicated minutes, lysed, and immunoblotted as indicated. α-Tubulin was the loading control. (B) HeLa cells were co-transfected with Flag-HA-Cyclin F WT and Flag-USP7 WT or empty vector. Forty-eight hours post transfection, cells were treated with CHX (50 μg/mL) for 75 min. Where indicated, P22077 (25 μM) was added to cells 2 h prior to the addition of CHX. Cells were then lysed, and immunoblotted as indicated. (C) HeLa cells were co-transfected with Flag-HA-Cyclin F WT and Flag-USP7 WT, Flag-USP7 CS, or empty vector. Forty-eight hours post transfection, cells were treated with CHX (50 μg/mL) for 75 min, lysed, and immunoblotted as indicated.

图5。USP7调节细胞周期蛋白F的稳定性。(A)用Flag-HA-Cyclin F WT和Flag-USP7 WT或空载体共转染HCT116细胞。转染24小时后，用DMSO或环己亚胺(CHX)处理细胞;50 μg/mL)指定分钟，裂解，按指定免疫印迹。α-微管蛋白为加载对照。(B)用Flag-HA-Cyclin F WT和Flag-USP7 WT或空载体共转染HeLa细胞。转染48小时后，细胞用CHX (50 μg/mL)处理75分钟。如有指示，在加入CHX前2小时加入P22077 (25 μM)。然后将细胞裂解，按指示进行免疫印迹。(C)用Flag-HA-Cyclin F WT和Flag-USP7 WT、Flag-USP7 CS或空载体共转染HeLa细胞。转染48小时后，细胞用CHX (50 μg/mL)处理75分钟，裂解，并按指示进行免疫印迹。

基因毒性应激下USP7与细胞周期蛋白F的关系

与之前的报道一致，我们观察到细胞周期蛋白F水平在dna损伤剂(如依托oposide)处理的细胞中下调(图2C)。这种下调部分归因于周期蛋白F在其atr依赖性泛素化后蛋白酶体降解增加[8]。因此，我们假设在DNA损伤的条件下，cyclin F和USP7之间的相互作用可能会减少，以提供cyclin F水平的强劲下调。为了评估内源性细胞周期蛋白F和USP7之间的相互作用在非应激和dna损伤条件下是如何受到影响的，我们对HeLa细胞提取物进行了内源性USP7的免疫沉淀。Western blot分析显示，cyclin F存在于抗usp7免疫沉淀中，但不存在于具有不相关的抗p- tak1抗体的对照免疫沉淀中(图6)。值得注意的是，这种关联在受到依托opo苷基因毒性应激的细胞中检测到很弱。与未处理或mg132处理的细胞相比(图6)。虽然在抗USP7免疫沉淀物中检测到的细胞周期蛋白F水平仅反映了相应总提取物中存在的细胞周期蛋白F水平(图6的输入通道)，但这些结果也似乎表明，细胞中USP7和细胞周期蛋白F之间的关联可能在响应DNA损伤时被破坏。

Interaction between USP7 and cyclin F under DNA-damaging condition. HeLa cells were treated with DMSO (control), etoposide (10 μM), or MG132 (10 μM) for 4 h. Endogenous USP7 was immunoprecipitated (IP) with anti-USP7 antibody or an unrelated, anti-p-TAK1 antibody (mock IP) as a loading control. Immunocomplexes were immunoblotted as indicated; β-actin was the loading control. Asterisk denotes non-specific band.

图6。dna损伤条件下USP7与cyclin F的相互作用。用DMSO(对照)、依托泊苷(10 μM)或MG132 (10 μM)处理HeLa细胞4小时。内源性USP7用抗USP7抗体或不相关的抗p- tak1抗体(模拟IP)免疫沉淀(IP)作为加载对照。按照指示对免疫复合物进行免疫印迹;β-肌动蛋白为加载对照。星号表示非特定波段。

讨论

在细胞周期过程中严格调控细胞周期蛋白F是避免细胞周期蛋白F底物计划外降解和保持基因组完整性的关键。然而，迄今为止，只有少数细胞周期蛋白F的相互作用物是已知的，并且调节细胞周期蛋白F丰度和SCFCyclin F泛素连接酶活性的分子机制仍然知之甚少。Cyclin F的半衰期小于1小时[3]。最初认为它经过金属蛋白酶介导的降解[20];然而，最近的证据表明，它也被泛素-蛋白酶体系统降解。已经确定了靶向细胞周期蛋白F的多个E3泛素连接酶;APC/CCdh1在G1期靶向cyclin F，在M期靶向SCFβTrCP，以及一种尚未确定的atr依赖性E3泛素连接酶在基因毒性应激下靶向它[8,18,21]。细胞周期蛋白F靶向E3泛素连接酶的鉴定表明，可能存在特异性去泛素化酶，其功能可以逆转细胞周期蛋白F的泛素化，并进一步微调其丰度和/或活性。

在这项研究中，我们确定了USP7是一种新的细胞周期蛋白F相互作用蛋白，并揭示了由这种相互作用介导的细胞周期蛋白F调节的新方面。USP7属于去泛素化酶的泛素特异性蛋白酶家族，并与多种蛋白质相互作用以改变其稳定性、定位和/或功能[31]。虽然这些相互作用物中的大部分通过USP7的去泛素化活性受到调节，但其他相互作用物不是直接靶标，但已知与USP7形成稳定的配合物[32]。我们发现cyclin F在体内与USP7结合。含有1-270氨基酸的cyclin F的截断突变体也与USP7相关，这表明cyclin-box和PEST区域在这种相互作用中是不可缺少的。值得注意的是，USP7的n端区域包含一个traf结构域，该结构域识别许多USP7相互作用蛋白中普遍存在的traf识别基序P/ a /E-x-x-S[31]。cyclin F的n端1-270区域包含多个公认的traf识别基序。这些基序是否对cyclin F和USP7之间的相互作用至关重要还有待确定。

令人惊讶的是，大量的USP7相互作用物是E3泛素连接酶[32]。例如，USP7和MDM2之间的相互作用导致USP7介导的MDM2去泛素化，增强了后者的稳定性[22,26]。另一方面，USP7与TRIM27(另一种E3泛素连接酶)之间的相互作用导致多种结果:USP7不仅使TRIM27去泛素化，而后者又与USP7结合并使USP7泛素化，从而促进USP7募集另一种蛋白质RIP1并使其去泛素化[33]。为了揭示细胞周期蛋白F-USP7相互作用的功能后果，我们首先研究了这两种蛋白如何相互影响。我们的数据表明，USP7与cyclin F结合，调节cyclin F的丰度和稳定性，而不是相反。首先，无论是强制表达cyclin F，还是抑制SCFCyclin F活性，都不会影响USP7蛋白水平。其次，USP7的异位表达增加了异位周期蛋白F的蛋白稳定性。然而，令我们惊讶的是，USP7诱导的周期蛋白F蛋白稳定性与USP7的去泛素酶活性无关。当USP7去泛素化酶活性被P22077抑制时，野生型USP7仍能稳定细胞周期蛋白F。同样，催化失活的USP7突变体也能够稳定cyclin F蛋白水平，类似于野生型蛋白。总之，这些观察结果表明，USP7间接调节细胞周期蛋白F的稳定性，可能是通过阻断SCFCyclin F对细胞周期蛋白F的自泛素化，或通过将细胞周期蛋白F与另一种E3泛素连接酶或非溶酶体蛋白酶分离。值得注意的是，我们的数据显示溶酶体蛋白酶不靶向细胞周期蛋白F降解。

与上面提到的USP7以去泛素酶活性不依赖的方式稳定cyclin F的过表达研究相反，用P22077或FT671处理异步生长的细胞导致内源性cyclin F蛋白水平的快速下调。这些后一种观察结果表明USP7对细胞周期蛋白F丰度的去泛素酶活性依赖性调节。我们的数据表明，这种去泛素酶活性依赖性对细胞周期蛋白F蛋白水平的影响可能源于USP7对细胞周期蛋白F mRNA的调节:P22077对USP7的药理抑制下调了细胞周期蛋白F mRNA水平。已知USP7调节许多转录因子的活性。因此，可以想象，USP7调节参与细胞周期蛋白F转录控制的特定转录因子或共调节因子的活性。或者，USP7可能调节对细胞周期蛋白F mRNA稳定性重要的因子。总的来说，值得注意的是，USP7既发挥去泛素酶活性依赖性作用，也发挥非依赖性作用来调节周期蛋白F的丰度。

在许多情况下，USP7在响应细胞应激时从E3泛素连接酶切换到其底物[32]。这种分子开关的一个主要例子是USP7对MDM2-p53轴的调节。在正常情况下，USP7与MDM2相互作用并稳定MDM2，导致泛素介导的靶标p53降解增强[22,26]。然而，当DNA损伤时，USP7从MDM2切换到p53，导致后者去泛素化和稳定[27]。我们假设USP7可能类似地作为调控细胞周期蛋白F的分子开关，从而调控其底物。需要进一步研究细胞周期蛋白F和USP7在正常细胞周期控制和基因毒性应激条件下的功能相互作用。

我们的数据预测，usp7抑制或-枯竭的细胞可能表达低水平的细胞周期蛋白F，并表现出中心体过度扩增和基因组不稳定。值得注意的是，通过直接或间接影响许多关键蛋白的稳定性，USP7的缺失会导致多个细胞系中中心体过度扩增、多极纺锤体、染色体错位和细胞动力学缺陷[34-36]。细胞周期蛋白F水平的降低是否有助于这些USP7消耗诱导的表型仍有待研究。USP7的表达在各种癌症类型中经常被错误调控，并具有上下文依赖的肿瘤抑制或致癌作用[31]。同样，在儿童白血病中也发现了USP7功能缺失突变[37]。虽然最初的证据表明细胞周期蛋白F具有肿瘤抑制功能，但新的报道表明，它在某些癌症中也可能具有环境依赖性的致癌功能[38]。因此，在这些特定情况下，研究USP7-cyclin F轴是否有助于肿瘤的进展和侵袭性将具有临床意义。

总之，在本研究中，我们发现了cyclin F的一个新的相互作用伙伴USP7，以及USP7在cyclin F mRNA和蛋白调控中的作用。这项研究强调了细胞周期蛋白F-USP7轴在病理条件下的潜在作用，包括癌症和神经退行性疾病。

材料与方法

表达载体

flag - ha标记的Cyclin F构建物是Dr. Michele Pagano (NYU Grossman School of Medicine, USA)赠送的礼物[15]。Flag-HA-Cyclin F1-270(截断突变体)以Flag-HA-Cyclin F野生型构建物为模板，通过定点诱变获得。通过测序验证了所需突变的存在。pQFlag-USP7-WT和pQFlag-USP7-CS分别购自Addgene(质粒#46751和#46752)。Goedele Maertens和Gordon Peters)。

细胞培养和转染

HEK-293T、HeLa和HCT116细胞系在DMEM (Sigma-Aldrich, MO, USA)中培养，DMEM含有10%胎牛血清(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)，并添加100 IU/mL青霉素和100 mg/mL链霉素(Thermo Fisher Scientific)。所有细胞系均保存在37°C加5% CO2的加湿培养箱中。如有指示，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific)用表达载体转染细胞。

化学抑制剂

蛋白酶抑制剂鸡尾酒组III和磷酸酶抑制剂鸡尾酒组V购自Sigma-Aldrich。如有需要，细胞分别用10或12.5 μM MG132 (Sigma-Aldrich)、3 μM MLN4924 (Sigma-Aldrich)、25 μM P22077 (Sigma-Aldrich)、10 μM FT671 (MedChemExpress, NJ, USA)和100 nM Bafilomycin A1 (Sigma-Aldrich)处理。

RNA分离和逆转录pcr

根据制造商的说明，使用TRI试剂(Sigma-Aldrich)从HeLa和HCT116细胞中纯化总RNA。用高容量cDNA反转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)从1 μg的总RNA中逆转录单链cDNA。RT反应产物取1微升，加入1x DreamTaq PCR主液(Thermo Fisher Scientific)，各引物0.5 μM，总反应体积为20 μL。使用的引物如下:1)human cyclin F:正向- 5'CCAGGGAACCTGAAGCTCTTT3 '和反向- 5'TCGCTTTCCCAGAGGAGGTA3 '; 2) human RPL35A:正向- 5'GGGTACAGCATCACTCGGA3'和反向- 5'ACGCCCGAGATGAAACAG3'。使用Eppendorf Mastercycler Nexus GX2进行PCR循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，溴化乙啶染色观察。采用RPL35A表达进行归一化。

免疫沉淀和免疫印迹

免疫沉淀提取:细胞裂解免疫沉淀缓冲液(50 mM HEPES, pH 7.2;150mm NaCl;1% np-40;1毫米EDTA;1:100稀释蛋白酶抑制剂鸡尾酒组III;1:50稀释磷酸酶抑制剂鸡尾酒V;0.5 mM二硫苏糖醇)。清除的裂解物与抗体孵育16小时，随后与蛋白A/ g琼脂糖珠(Thermo Fisher Scientific)在旋转器上4°C孵育2小时。免疫复合物用免疫沉淀缓冲液洗涤3次，洗脱的结合蛋白用8%或12% sds -聚丙烯酰胺凝胶溶解。其他实验用RIPA缓冲液(50 mM HEPES, pH 7.2;150mm NaCl;1% np-40;0.5%脱氧胆酸钠;0.1% sds;1毫米EDTA;1:100稀释蛋白酶抑制剂鸡尾酒组III, 1 mM原钒酸盐;5 mM NaF;和1mm二硫苏糖醇)。电泳后，蛋白质被转移到PVDF膜上。在含有0.1% Tween-20和添加5%脱脂奶粉的tris缓冲盐水中进行一抗阻断和孵育。采用ChemiDoc XRC+凝胶成像系统(Bio-Rad, CA, USA)，使用辣根过氧化物酶偶联抗体和增强化学发光试剂(femtoLucent + hrp, G-Biosciences, MO, USA)对蛋白进行可视化。

抗体来源

细胞周期蛋白F (D9K2U)、USP7 (D17C6)、UBR5 (D6O8z)、LC3 (4775S)和β-Actin (13E5)抗体来自Cell Signaling Technology (MA, USA)。抗ha探针(F7)来自Santa Cruz (texas, USA)，抗细胞周期蛋白A2 (BF683)来自Bethyl Laboratories (texas, USA)，抗p53 (DO7)来自Abcam (Cambridge, UK)，抗兔和抗鼠IgG-HRP来自Genei Laboratories (Bangalore, India)，抗兔IgG-HRP来自Cloud-Clone Corp (texas, USA)。

数据可用性声明

作者确认，支持本研究结果的数据可在文章中获得。

作者的贡献

SSS构思研究，进行实验，分析和解释数据，并撰写手稿。WJP为蛋白质组学研究提供资源，分析蛋白质组学结果，并批判性地阅读稿件。PK提供资源，解释数据，批判性地阅读稿件，并提供编辑建议。

致谢

Flag-HA-Cyclin F构建物是Michele Pagano博士赠送的礼物[15]。质谱分析在莫菲特癌症中心蛋白质组学核心设施进行。这项工作得到了印度政府科学技术部的资助，项目编号:SR/WOS-A/LS-82/2017至SSS。PK是印度国家科学院高级科学家奖学金的获得者。SSS和PK还感谢DBT-IISc伙伴关系计划对基础设施的支持。

编者按:该论文已被接受，部分基于之前另一家期刊的同行评议和随后的额外同行评议的反驳。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

资金

本研究未获资助。

编辑注意

这篇论文被接受的部分依据是另一家期刊之前的同行评议和随后的额外同行评议。

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相应的作者

Savitha S. Sharma
savitha.sharma@ssnccpr.org

关键字
细胞周期蛋白F 非典型细胞周期蛋白 USP7 细胞周期 基因组的完整性
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