介绍

骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)是儿童和青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤，发生转移后的5年生存率不到20%。1,2尽管肿瘤诊断和治疗取得了进步，但OS的内在异质性严重阻碍了临床结果的改善，这被认为与其转移倾向和化疗耐药有关先前的研究测试了不同的OS细胞系，在体内致瘤性和体外集落形成能力方面发现了不同的表型实验结果的可靠性可能受到选择合适的细胞系进行os相关研究的影响。然而，OS细胞系间异质性的机制尚不清楚。

基质刚度是正常细胞适当发育的机械转导的最关键组成部分之一。当细胞附着在细胞外基质(ECM)上时，需要复杂的细胞机械感应活动来产生适当的生长信号，以维持生存、生长或死亡刚性传感组分的功能主要由激酶(如EGFR、HER2、ROR2和AXL)和细胞骨架蛋白(如MYH9、TPM1、TPM2、TPM3、FLNA、ACTN1和ACTN4)决定。在正常的细胞生长过程中，当细胞失去与附近支撑物的连接时，就会激活失活过程转化生长或抗肿瘤是指恶性肿瘤细胞能够逃避环境依赖条件而存活的一种状态早期的研究表明，缺乏附着于ECM产生的正常信号可能导致人类OS细胞的anoikis抗性然而，尚不清楚在OS细胞系中是否存在刚性传感元件的改变或是否有助于致瘤性。

野生型TP53蛋白作为一种转录因子，直接与特定的DNA序列结合，调控数百个基因，控制多种细胞反应，共同防止肿瘤发生。TP53基因在大约一半的人类恶性肿瘤中发生突变，大多数突变导致dna结合域内的单个氨基酸替代。12,13突变型TP53的三个致癌属性被假设为:无法激活抑制肿瘤的靶基因(功能丧失)，在早期转化阶段缺乏野生型TP53的阻断功能(显性负作用)，以及存在促进癌细胞增殖和细胞凋亡逃逸的致癌特征(功能获得，GOF) 13目前认为，OS患者的TP53突变频率在47%至90%之间，远高于最初确定的频率。此外，一项包括来自8项试验的210名OS患者的荟萃分析显示，TP53突变对总生存率有不利影响在许多恶性肿瘤中，包括人类乳腺癌、人类纤维肉瘤和小鼠肺癌，已经观察到形成主动刚性传感模块的能力丧失在套细胞淋巴瘤中，参与肌动蛋白细胞骨架组织和细胞粘附的基因下调与TP53通路有关研究发现突变体TP53通过EGFR/整合素信号通路增加人非小细胞肺癌细胞的侵袭和转移活性突变体TP53在不同OS细胞系中的作用目前尚不清楚，其通过控制刚性感知对致瘤性的贡献仍然未知。

我们检测了OS细胞系的致瘤性、anoikis耐药性和机械传感功能，并在转化的OS细胞中检测了anoikis耐药性。有趣的是，转化后的OS细胞的机械传感功能受损，刚性传感蛋白普遍下调。此外，我们根据OS细胞中硬度敏感成分的表达模式确定了正常生长和转化生长之间的切换。TP53的GOF突变体(R156P)在控制恶性OS细胞的刚性感知功能中发挥了关键作用，而不是机械传感器蛋白YAP1。我们的研究结果为突变体TP53在抑制刚性感知中的作用提供了新的见解，并表明机械感知的丧失是维持OS细胞致瘤性的关键因素。

结果

不同的OS细胞系对anoikis的抗性不同

我们从异种移植模型开始分析U2OS、MG63、HOS和143B细胞的致瘤性。HOS和143B细胞迅速形成肿瘤，在5周内生长到1 000 mm3体积，而U2OS和MG63细胞不形成肿瘤(图1a)。接下来，我们在体外用球形成实验测试了OS细胞系的致瘤性。悬浮培养7天后，HOS和143B细胞形成球形，但U2OS和MG63细胞培养中未见球形(图1b, c)。我们还使用小鼠肿瘤细胞外基质蛋白混合物Matrigel建立了三维培养模型。与体内致瘤性和体外成球实验结果一致，我们发现HOS和143B细胞可以在Matrigel中形成球形集落，而U2OS和MG63细胞不能(图1d-f)。Anoikis是由正常细胞中细胞-基质相互作用的破坏引起的，漂浮培养是一种经典的诱导Anoikis的方法，在以前的许多研究中都有报道。19,20,21,22为了解释致瘤性的差异，我们量化了附着缺失条件下OS细胞中anoiisk相关蛋白的表达水平。与单层培养条件相比，我们观察到漂浮培养3天后U2OS细胞中BAX、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9的蛋白水平增加，而143B细胞中这些水平没有差异(图1g-j)。因此，不同OS细胞系之间的致瘤性存在显著差异，并且在恶性OS细胞系(143B和HOS细胞)中发现了anoikis耐药性。

图1
figure 1

骨肉瘤细胞系对肿瘤的不同程度的抗性。a皮下植入肿瘤模型中来自不同骨肉瘤细胞系的肿瘤体积。每组N = 5;数据以平均数表示。U2OS、MG63、HOS和143B细胞球培养7天(b)和定量(c)，每组n = 12;数据以平均数表示。Matrigel对U2OS、MG63、HOS和143B细胞进行3D培养2周(d)和定量(e, f)，每组n = 5;数据以平均值±标准差表示。值。单层或浮培养U2OS细胞中气味相关蛋白的代表性Western blot (g)和定量(h)，每组n = 3;数据以平均值±标准差表示。值。单层或浮培养143B细胞中具有代表性的气味相关蛋白的Western blot (i)和定量(j)，每组n = 3;数据以平均值±标准差表示。值。图表显示了从三个独立的测量和平均值中得出的单个数据点。* p < 0.05;**** p < 0.000 1;### p < 0.001;#### p < 0.000标尺，50 μm

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转化的OS细胞系刚性感知功能受损

刚性传感模块对细胞收缩至关重要，正常细胞的收缩通常是短暂的，柔软表面上的粘连会迅速分解，这可能导致细胞死亡因此，我们试图检查转化的OS细胞的机械传感功能是否受到损害。将U2OS、MG63、HOS和143B细胞接种于玻璃表面，观察到HOS和143B细胞的局灶粘连(FA)面积和细胞骨架强度下降(图2a-c)。此外，我们合成了不同硬度的水凝胶来评估OS细胞系的细胞极化。值得注意的是，在软表面上，U2OS和MG63细胞的长宽比明显降低，而HOS和143B细胞的长宽比没有明显差异(图2d, e)。在软琼脂中克隆生长被广泛认为是转化细胞的经典表型因此，我们将OS细胞系在软琼脂中培养2周，形成了HOS和143B细胞的菌落(图2f-h)。总的来说，我们的研究结果表明，转化的OS细胞系(HOS和143B细胞)的刚性感知功能受损。

图2
figure 2

骨肉瘤细胞系间刚性感知功能的差异。U2OS、MG63、HOS和143B细胞在玻璃表面过夜(a)和定量(b、c)时paxillin(绿色)和actin(红色)染色，每组n = 5场;数据以平均值±标准差表示。值。U2OS、MG63、HOS和143B细胞在刚性(40 kPa)或软质(4 kPa)水凝胶表面过夜(d)和定量(e)中肌动蛋白染色(红色)，每组n = 5场;数据以平均值±标准差表示。值。U2OS、MG63、HOS和143B细胞软琼脂培养2周(f)和定量(g, h)，每组n = 5场;数据以平均值±标准差表示。值。图表显示了从三个独立的测量和平均值中得出的单个数据点。** p < 0.01;*** p < 0.001;**** p < 0.000 1;## p < 0.01;### p < 0.001。标尺，50 μm

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基于传感蛋白在正常生长和转化生长之间切换

迄今为止报道的刚性感应蛋白包括四种激酶和七种细胞骨架蛋白。我们试图通过量化传感器蛋白的表达水平来解释OS细胞的刚性感知功能受损。通过定量蛋白质组学，我们发现HOS和143B细胞中传感器相关蛋白(ERBB2、AXL、MYH9、FLNA、TPM1、TPM2、ACTN1和ACTN4)水平降低，但EGFR和TPM3水平升高(图3a)。Western blot分析进一步证实了143B细胞中TPM1和TPM2水平下降，而TPM3水平升高(图3b, c)。由于原肌球蛋白是机械传感机制的重要组成部分，在正常细胞中控制肌瘤样收缩并抑制软基质上的生长，8我们选择了TPM1和TPM2高表达的U2OS细胞和TPM3高表达的143B细胞进行进一步的实验。在U2OS细胞中内源性TPM1或TPM2耗尽后(图1a - d)，玻璃表面的FA面积显着减少(图3d-f)。U2OS细胞的极化在刚性表面被抑制，而在柔软表面被促进(图S2a)，表明刚性感知受损(图3h)。为了测试TPM3是否抑制刚性感知，我们在143B细胞中沉默内源性TPM3(图S1e, f)。这种修饰后FA面积显著增加(图3d-f)。143B细胞在刚性表面上极化增强，而在柔软表面上极化抑制(图S2b)，表明刚性感知恢复(图3i)。此外，内源性TPM3耗尽后，在软琼脂实验(图3j - 1)和球培养(图3m, n)中，143B细胞的转化生长明显受到抑制。我们的数据揭示了基于刚性传感蛋白表达模式的OS细胞系正常生长和转化生长之间的切换。

图3
figure 3

基于传感蛋白在正常生长和转化生长之间切换。a通过定量蛋白质组学测定，与未转化细胞(hFOB, U2OS和MG63)相比，转化细胞(HOS和143B)中传感器蛋白表达水平的降低。每组N = 3;数据以平均数表示。U2OS和143B细胞中传感器蛋白(TPM1、TPM2和TPM3)的代表性Western blot (b)和定量(c)，每组n = 3;数据以平均值±标准差表示。值。TPM1和tpm2沉默的U2OS细胞和tpm3沉默的143B细胞在玻璃表面过夜(d)和定量(e, f)进行paxillin染色(绿色)，每组n = 5场;数据以平均值±标准差表示。值。TPM1或tpm2沉默的U2OS细胞和tpm3沉默的143B细胞在刚性(40 kPa)和软质(4 kPa)水凝胶表面过夜(g)和定量(h, i)中肌动蛋白染色(红色)，每组n = 5场;数据以平均值±标准差表示。值。tpm3沉默143B细胞软琼脂培养2周(j)和定量(k, l)，每组n = 5场;数据以平均值±标准差表示。值。tpm3沉默143B细胞球培养7天(m)和定量(n)，每组n = 5场;数据以平均值±标准差表示。值。图表显示了从三个独立的测量和平均值中得出的单个数据点。* p < 0.05;** p < 0.01;**** p < 0.000标尺，50 μm

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刚性感应蛋白不受YAP1

我们尝试使用ChEA3预测刚性传感蛋白的上游转录因子，并鉴定出TEAD1、TEAD3和TEAD4(图S3)。从机制上讲，YAP1可以结合到TEADs (TEAD1-4)，然后促进靶基因的表达，包括细胞周期、细胞迁移和细胞命运的调节因子我们观察到，与U2OS细胞相比，143B细胞中的YAP1核胞质(N/C)比例降低，20个YAP1靶基因中有12个下调(图4a-c)，表明143B细胞中缺乏YAP1激活。因此，我们试图确定这些刚性传感蛋白是否位于YAP1的下游。定量蛋白质组学发现U2OS细胞中传感器相关蛋白(ERBB2、AXL、MYH9、FLNA、TPM1、TPM2、ACTN1和ACTN4)上调。在U2OS细胞中沉默内源性YAP1后(图S1g, h)，我们没有观察到刚性感应基因的表达减少(图4d)。此外，在玻璃表面培养的U2OS和143B细胞中，p-YAP1和YAP1的水平是相当的(图4e, f)。然而，在tpm1缺失的U2OS细胞中，YAP1的N/C比值显著降低(图4,h)，而在TPM3敲低的143B细胞中，YAP1的N/C比值显著增加(图4,j)。综上所述，我们的数据表明，刚性传感蛋白不受YAP1的调节，但YAP1的核分布是由刚性传感蛋白驱动的。

图4
figure 4

传感器蛋白介导YAP1的亚细胞定位。玻璃表面培养的U2OS和143B细胞(a) YAP1染色(绿色)和YAP1定位定量(b)，每组n = 5场;数据以平均值±标准差表示。值。c玻璃表面培养的U2OS和143B细胞中YAP1靶基因的表达。每组N = 3。d在yap1沉默的U2OS细胞中刚性敏感基因的表达。每组N = 5;数据以平均值±标准差表示。值。玻璃表面培养U2OS和143B细胞中YAP1和p-YAP1的代表性Western印迹(e)和定量(f)，每组n = 3;数据以平均值±标准差表示。值。玻璃表面培养tpm1沉默的U2OS细胞YAP1染色(绿色)(g)及YAP1定位定量(h)，每组n = 5场;数据以平均值±标准差表示。值。tpm3沉默143B细胞在玻璃表面的YAP1染色(绿色)(i)和YAP1定位的定量(j)，每组n = 5场;数据以平均值±标准差表示。值。图表显示了从三个独立的测量和平均值中得出的单个数据点。** p < 0.01;*** p < 0.001。标尺，50 μm

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的基因突变TP53在转化的OS细胞系中

越来越多的证据表明，TP53的突变可以促进癌细胞的运动、侵袭和转移有趣的是，ChEA3预测还确定TP53是传感器蛋白的上游转录因子之一(图S3)。从COSMIC数据库中获得OS患者中突变频率最高的20个基因，发现TP53突变频率最高，为25%(图S4)。因此，我们研究了TP53在OS细胞系中的潜在作用。令人惊讶的是，Sanger测序证实了HOS和143B细胞中的TP53突变(C . 467g > C)(图5a)。这种错义突变(R156P)位于TP53 dna结合域(图5b)，根据HumDiv和HumVar模型预测它可能具有破坏性(图S4a)。通过使用AlphaFold预测TP53的结构，我们观察到ARG 156和GLU 204之间存在氢键(图S4b)，这表明TP53的错义突变(R156P)可能会影响其二级蛋白结构。与U2OS和MG63细胞相比，HOS和143B细胞中的TP53蛋白水平高出100倍以上(图5c, d)，核质TP53的强度在143B细胞中也显著增加(图5e, f)。值得注意的是，143B细胞中积累的TP53蛋白并没有激活而是抑制其下游靶基因的表达(图5g)。

图5
figure 5

转化骨肉瘤细胞系中TP53突变体的研究。使用Sanger测序方法鉴定了HOS和143B细胞中的TP53突变。b HOS和143B细胞中突变体TP53蛋白氨基酸取代的代表性结构(红色)。U2OS、MG63、HOS和143B细胞中TP53的代表性Western blot (c)和定量(d)，每组n = 3;数据以平均值±标准差表示。值。玻璃表面U2OS和143B细胞TP53染色(黄色)(e)和定量(f)，每组n = 5场;数据以平均值±标准差表示。值。g玻璃表面培养的U2OS和143B细胞中TP53靶基因的表达。每组N = 3。图表显示了从三个独立的测量和平均值中得出的单个数据点。*** p < 0.001;**** p < 0.000 1;### p < 0.001。标尺，50 μm

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虽然突变型TP53再激活的确切机制仍有待阐明，但APR-246已被证明可以通过恢复野生型TP53功能来有效克服GOF活性然后，我们用APR-246处理转化的OS细胞，验证突变体TP53 (R156P)的GOF。虽然TP53蛋白表达水平不变，但APR-246处理后，突变型TP53的143B细胞活力明显降低，但对野生型TP53的U2OS细胞未见不良反应(图S5a-c)。此外，在软琼脂实验(图S5d、e)、漂浮培养(图S5f、g)和异种移植小鼠(图S5h、i)中，APR-246处理显著抑制了143B细胞的生长。总的来说，我们的数据表明，在HOS和143B细胞中存在TP53 (R156P)突变，并揭示了其在这些OS细胞系中的GOF。

突变体TP53抑制转化OS细胞的刚性感知

考虑到突变体TP53在转化的OS细胞系中的GOF，我们下一步研究了它在调节刚性感应蛋白中的潜在作用。我们观察到，在143B细胞中，除了EGFR和TPM3外，刚性敏感基因(ERBB2、AXL、MYH9、FLNA、TPM1、TPM2、ACTN1和ACTN4)的表达显著降低(图6a)。在143B细胞中去除内源性TP53后，我们发现刚性敏感基因的表达显著增加，包括ERBB2、MYH9、TPM1、TPM2、TPM3和ACTN1，以及先前上调的EGFR表达受到抑制(图6b-d)。在tp53缺失的143B细胞中，玻璃表面的FA面积显著增加(图6e, f)，软表面的细胞纵横比显著降低(图6g, h和S2c)。此外，143B细胞中TP53的缺失抑制了它们在软琼脂(图6i-k)和球培养(图6l, m)中的转化生长。总的来说，这些结果支持突变型TP53抑制转化OS细胞的刚性感知，而143B细胞中内源性TP53的缺失恢复了刚性感知，从而抑制了转化生长。总之，我们的数据揭示了突变体TP53在抑制转化的OS细胞的刚性感知功能方面的新GOF。

图6
figure 6

突变体TP53抑制转化骨肉瘤细胞的刚性感知。a U2OS和143B细胞中刚性敏感基因的表达。每组N = 3。tp53沉默143B细胞的代表性Western blot (b)和定量(c)，每组n = 3;数据以平均值±标准差表示。值。d tp53沉默的143B细胞中硬度敏感基因的表达。每组N = 5;数据以平均值±标准差表示。值。tp53沉默143B细胞(e) paxillin染色(绿色)和定量(f)，每组n = 5场;数据以平均值±标准差表示。值。tp53沉默的143B细胞在刚性(40 kPa)或软质(4 kPa)水凝胶表面培养过夜(g)并定量(h)，每组n = 5场;数据以平均值±标准差表示。值。tp53沉默143B细胞软琼脂培养2周(i)和定量(j, k)，每组n = 5场;数据以平均值±标准差表示。值。tp53沉默的143B细胞球培养7天(l)和定量(m)，每组n = 5场;数据以平均值±标准差表示。值。图表显示了从三个独立的测量和平均值中得出的单个数据点。* p < 0.05;** p < 0.01;*** p < 0.001。标尺，50 μm

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讨论

OS异质性的起源尚不清楚，致瘤性和机械转导的变化一直是人们强烈关注的焦点。我们的研究结果表明，刚性感知作为细胞感知物理微环境的一个元素，在OS致瘤性中起着重要作用。值得注意的是，我们的研究结果表明，转化后的OS细胞的刚性感知功能受到损害，并且转化后的生长可以根据传感器蛋白的表达模式进行调节。我们发现机械转导蛋白YAP1不直接调节刚性感应分子，而YAP1的核分布受刚性感应蛋白的调节。在机制上，我们在转化的OS细胞中发现了一种新的TP53突变，该突变导致GOF抑制刚性感知功能，从而维持转化的生长。

基础研究中使用的OS细胞系的致瘤性差异很大，造成OS细胞系间致瘤性差异的根本原因尚不清楚我们在体外和体内测试了OS细胞系的致瘤性，在具有侵袭性表型的OS细胞系(143B和HOS细胞)中发现了anoikis抗性。既往研究报道，骨肉瘤的肺转移是常见的，并归因于骨肉瘤细胞的anoikis耐药性由于附着于ECM而产生的正常信号的缺失可能构成anoikis抵抗的驱动力在功能上，OS细胞表现出不同的刚性感知模式，包括在刚性或柔软表面培养时的病灶粘附面积、细胞骨架力、细胞形状和非锚定生长的差异。底物硬度对OS细胞扩散和聚集的影响已经被研究过，发现MG63和U2OS细胞在软底物上培养时形成多细胞聚集体类似地，另一项研究报道MG63细胞对ECM粘附敏感，类似于人类胎儿成骨细胞(hFOB)在2D和3D培养中的观察结果在本研究中，刚性感应功能被证明可以阻止U2OS和MG63细胞在软基质表面或非贴壁条件下的致瘤生长。这表明，在选择细胞系用于基于矩阵的3D培养模型或体内研究时，需要非常谨慎。此外，我们的研究结果表明，转化后的OS细胞的刚性感知功能受到损害，研究这些侵袭性OS细胞的分子机制具有重要意义。

许多激酶和细胞骨架蛋白参与了刚性感应组分的形成我们试图通过量化传感器蛋白的表达来解释OS细胞的刚性感知功能受损。U2OS和MG63细胞中传感蛋白的表达模式与hFOB细胞相似，而143B和HOS细胞中大部分传感蛋白(ERBB2、AXL、MYH9、FLNA、TPM1、TPM2、ACTN1和ACTN4)的表达水平降低。在上皮细胞中，MYH9和TPM2是响应刚性和张力的血管蛋白与e -钙粘蛋白结合所必需的然而，在许多癌细胞中缺乏刚性感应成分可能会促进它们在软环境中的扩散。大脑是一个非常柔软的组织，TPM2的丢失已被证明可促进患者源性胶质母细胞瘤细胞在软基质上的定植刚性传感模块已经在许多转化细胞系中进行了免疫印迹分析，包括人乳腺癌细胞系MDA-MB-23、纤维肉瘤细胞系HT1080和小鼠肺癌细胞系LCC。所有这些转化的细胞系都至少缺少一个刚性感应模块此外，在不同的预后风险模型中，TPM1和FLNA已被确定为OS患者生存的独立保护因素。1,31我们的数据显示，在内源性TPM1、TPM2和TPM3耗尽后，OS细胞系的正常生长和转化生长之间会发生切换，这种切换依赖于刚性传感器蛋白的表达。有趣的是，我们发现TPM3在HOS和143B细胞中高表达，并抑制刚性感知。据报道，在各种癌基因转化的细胞中，TPM2的表达减少，TPM3的表达增加TPM2与TPM3在相同的肌动蛋白丝上共聚，据报道，TPM2与TPM3在人包皮成纤维细胞中发生竞争同样，在小鼠肌肉中发现过表达TPM3会降低内源性TPM2的表达，并在较小程度上降低TPM1.33的表达。因此，这些重要的传感蛋白是有希望的OS治疗靶点。

TP53是OS中最常见的突变基因，我们的数据揭示了一个新的突变(R156P)，并验证了HOS和143B细胞中相应突变的GOF。在Li-Fraumeni综合征小鼠模型中，在TP53内源性突变等位基因(对应于R127H突变)的杂合小鼠中发现转移性骨肉瘤的发生率增加与亲代MG63细胞相比，异位表达TP53突变体(R248W/P72R)的MG63细胞表现出增强的球形形成和克隆生长，这表明这种GOF可能是MG63细胞向癌症干细胞去分化的根本原因与U2OS和MG63细胞相比，我们发现HOS和143B细胞中TP53蛋白的异常积累。在OS组织中，TP53的表达与凋亡指数呈负相关，TP53的表达可以作为预测OS进展和预后的潜在生物标志物。令人惊讶的是，我们在143B细胞中观察到内源性TP53缺失后，刚性感知基因的表达增加，这些结果表明突变体TP53在调节刚性感知蛋白方面的功能缺失。值得注意的是，TP53敲低后，TMP3 mRNA的表达进一步增加。造成这种现象的原因可能是突变体TP53对转化OS细胞中激酶(EGFR和ERBB2)的特异性调控作用。ERBB信号通路是一个庞大而复杂的系统，它调节下游RAS/MAPK、AKT、JAK/STAT和Src/FAK信号轴参与肿瘤细胞迁移，TPM3是“癌症通路”网络的一个组成部分(KEGG: map05200)特别是Src/FAK信号轴在局部粘附和刚度感知过程中起重要作用突变体TP53与ERBB信号通路之间的潜在反馈回路值得进一步探索。细胞刚性感知在控制正常生长中的重要性已得到强调然而，即使在附件丢失的情况下，刚性传感模块的损耗也是癌症进展的一个有利因素我们的研究结果首次揭示了一种新的TP53 GOF突变，这可能是OS细胞刚性感知功能障碍的根本原因。这些发现表明，在OS患者中普遍筛查TP53变异和开发针对致癌性TP53的精确癌症治疗是有用的。

总之，我们的研究结果表明，刚性传感成分在骨肉瘤致瘤性中发挥了基本作用，就像细胞感知物理微环境的机械转导元件一样。转化后的OS细胞株刚性感知功能受损，刚性感知蛋白的表达模式可以调节转化后的OS细胞生长。在机制上，我们在转化的OS细胞系中发现了一种新的TP53突变，该突变导致GOF抑制刚性感应蛋白的表达，从而维持转化的生长。鉴于其强大的致癌活性，TP53的GOF突变体可能是这些恶性程序的执行者。

材料与方法

细胞培养和试验

hFOB细胞(Procell)在添加10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco 's modified Eagle 's培养基/F12中，在34°C的5% CO2培养箱中培养。143B细胞(BNCC)在添加10%胎牛血清的Roswell Park Memorial Institute-1640培养基中，37°C 5% CO2培养箱中培养。U2OS细胞(Procell)在添加10%胎牛血清的McCoy 's 5A培养基中于37℃5% CO2培养箱中培养。MG63细胞(Procell)在5% CO2培养箱中37℃培养，MEM中添加10%胎牛血清。

在成球实验中，将单细胞悬液(每孔1 000个)接种于96孔超低贴壁板(康宁)，在n2b27定义的无血清培养基中接种7天。用苦艾酒建立三维培养模型。简单地说，在冰上解冻后，将Matrigel与细胞悬浮液以1:1的体积混合。将混合物滴入24孔板中央(50 μL，每孔2 000个细胞)，37℃孵育10 min，细胞在完全培养基中培养2周。在6孔超低贴壁板(康宁)上用完全生长培养基进行漂浮培养。软琼脂实验在6孔板中使用两层不同浓度的琼脂糖凝胶进行。为了形成固化层，将0.5%琼脂糖与生长培养基混合，并在室温下放置至凝胶凝固。在培养基中加入0.4%琼脂糖形成上层。然后将细胞悬液(每孔10000个)加入到上述混合物中，并快速添加到6孔板中。上层琼脂糖层固化后，OS细胞在杨氏模量<2 kPa的琼脂上孵育2周。APR-246 (MCE)处理后，根据制造商的说明，使用cell Counting Kit-8 (Beyotime)在96孔板上进行细胞活力测定。

体内致瘤性试验

动物实验按照实验动物福利伦理委员会批准的方案进行。采用hFOB细胞和OS细胞系(U2OS、MG63、143B和HOS)建立BALB/c裸鼠异种移植模型。简单地说，将100 μL无血清培养基中的单细胞悬液(1 × 106个细胞)皮下注射到BALB/c-nu小鼠体内。为了验证突变体TP53功能的获得，我们将143B和HOS细胞皮下注射到BALB/c-nu小鼠体内。一旦肿瘤体积超过150 mm3，小鼠被随机分配到治疗队列，然后通过腹腔注射给药(0.9%生理盐水)或APR-246 (50 mg·kg - 1, 0.9%生理盐水)。每天注射，连续7天。每周测量肿瘤大小，肿瘤体积计算公式为:(长×宽×高)/2。小鼠在肿瘤体积达到1 500 mm3或长轴长度达到20 mm之前被杀死。对于低致瘤性和非致瘤性细胞系，5周后停止实验。

软硬聚乙二醇水凝胶表面的制备

为了给细胞培养提供柔软和坚硬的表面，根据先前的报道制备了PEG水凝胶和肽偶联物PEG-MAL (5 mmol·L−1)和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(ggygygrgdsspg)在37℃的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中溶解1 h。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽通过多肽上的半胱氨酸残基与PEG-MAL主链上的马来酰亚胺之间的Michael加成，共价偶联到PEG-MAL主链上。然后，加入不同浓度的PEG-SH交联剂与双肽修饰的PEG-MAL反应。通过改变PEG-SH的浓度，水凝胶的硬度可以在2到41 kPa之间独立调节，从而可以制备软(4 kPa)和硬(40 kPa)的水凝胶表面用于细胞播种。

siRNA转染和免疫印迹

细胞播种过夜后，混合TPM1、TPM2、TPM3、YAP1和TP53 siRNA (Tsingke)和Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)，第二天转染。对照细胞转染重组siRNA (Tsingke)。在第3天验证敲除效率，然后将细胞用于进一步的实验。为了进行免疫印迹，细胞在添加1%苯甲磺酰氟的放射免疫沉淀测定缓冲液中裂解，并用比辛胆酸法进行蛋白质定量。提取的蛋白经10%凝胶电泳分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜与以下一抗在4°C下孵育过夜:抗gapdh (Proteintech，稀释1:50 000)、抗bax (Proteintech，稀释1:2 000)、抗caspase -3 (Proteintech，稀释1:1 000)、抗caspase -9 (CST，稀释1:1 000)、抗tpm1 (Proteintech，稀释1:1 000)、抗tpm2 (Proteintech，稀释1:1 000)、抗tpm3 (Proteintech，稀释1:50 000)、抗yap1 (Santa Cruz，稀释1:50 000)、抗p- yap1 (CST，稀释1:1 000)、抗tp53 (Proteintech，稀释1:1 000)。一抗结合检测使用增强化学发光与适当的辣根过氧化物酶偶联二抗体。

基因表达谱

为了进行转录组分析，用PBS洗涤细胞，使用RNAiso (Takara)和总RNA提取试剂盒(JIANSHI)分离总RNA，按照制造商的指南确定。采用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测定RNA浓度，取总RNA 1 μg制备文库，装于Illumina HiSeq仪器进行RNA测序。转录组绘制完成后，使用RNA-Seq将基因表达谱量化为每百万绘制reads中每千碱基的转录片段。实时荧光定量PCR检测。采用带gDNA wiper的HiScript II RT SuperMix (Vazyme)合成cDNA，加入ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Vazyme)，在ABI QuantStudio 3机器(Thermo Fisher Scientific)上定量靶基因的相对表达量。基因特异性引物列于表S1。

采用串联质量标签法进行定量蛋白质组学分析简单地说，hFOB, U2OS, MG63, HOS和143B细胞用SDT缓冲液(4% SDS, 1 mmol·L−1 DTT, 100 mmol·L−1 Tris-HCl (pH 7.6))裂解。蛋白定量采用双霉素酸测定试剂盒，蛋白酶解采用过滤辅助样品制备技术。根据串联质量标记试剂盒的说明进行标记，标记后的样品被分离消化生成多肽。每个肽段使用连接到Easy nLC系统的纳米LC-MS /MS仪器(Thermo Fisher Scientific)进行鉴定。使用Proteome Discoverer 1.4中安装的MASCOT引擎(2.2版)搜索MS/MS光谱。

荧光显微镜及分析

用4%多聚甲醛固定细胞15分钟，然后用0.5% Triton®X-100孵育。然后用1%牛血清白蛋白在PBS中阻断1小时，与抗Paxillin (Proteintech, 1:200)、YAP1 (Santa Cruz，稀释度1:100)和TP53 (Proteintech，稀释度1:100)的一抗在4°C下孵育过夜，然后与二抗在37°C下孵育2小时。使用Harmony高含量成像分析软件(PerkinElmer)获取荧光图像并进行分析。YAP1 N/C定义为细胞核与细胞质中YAP1的浓度之比，用细胞核中平均荧光强度除以减去背景荧光后的细胞质中平均荧光强度来评估。41 .胞质区域是通过产生从核边界延伸0.5 μm到胞质的掩膜来确定的细胞骨架在37℃下用phalloidin染色1小时，并用纹理特性来量化细胞区域内细胞骨架的强度。纹理特征分析方法包括SER特征提取、Haralick特征提取和Gabor滤波。SER特征通常是对细胞进行分类的最佳方法，SER脊被计算为相应过滤图像在相应对象上的平均强度。根据Harmony高含量成像和分析软件(PerkinElmer)的制造商指南对SER特征进行量化。

Sanger测序和蛋白质结构预测

使用DNA Mini Kit (Qiagen)从U2OS、MG63、143B和HOS细胞中提取DNA。PCR扩增后，使用ABI 3730基因分析仪(Thermo Fisher Scientific)进行Sanger测序，确认TP53突变(C . 467g > C)。用polyphen2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml)，42)和AlphaFold (https://www.alphafold.ebi.ac.uk).43)预测TP53的蛋白结构，用ChEA3 (https://maayanlab.cloud/chea3/).44)预测刚性敏感基因的转录因子OS患者中TP53突变的频率来源于COSMIC数据库(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic).45)

统计分析

使用GraphPad Prism软件(8.2.1版本)进行数据分析和绘图。对显著性差异的分析采用双尾Student 's t检验，对于两组以上的比较，采用Mann-Whitney U检验或单向方差分析。利用ImageJ软件(1.52版)基于灰度值计算蛋白的相对表达量。该图显示了由三个独立测量得出的单个数据点和平均值，P值<0.05认为差异具有统计学意义。