CRISPR/ cas9定向表观遗传编辑揭示的多种转录调控和功能效应

摘要

DNA甲基化是一种表观遗传过程，控制DNA的可及性，并作为转录组开关沉积在调控区域。这一过程的充分运作对于组织稳态和细胞命运的决定是必不可少的。相反，DNA甲基化模式的改变会导致异常的基因转录谱，从而导致肿瘤的发生和发展。然而，由于缺乏原位靶向DNA甲基化的技术，DNA甲基化对基因表达和细胞命运的影响是否与细胞类型或状态无关，目前还没有得到验证。在这里，我们利用CRISPR/dCas9技术，通过DNA甲基化的位点特异性靶向来适应表观遗传编辑，表征候选基因的转录变化及其在不同肿瘤环境下对细胞命运的功能影响。作为概念验证，我们能够通过子细胞诱导IGFBP2基因启动子的从头特异性甲基化高达90%，并具有长期和真正的遗传。引人注目的是，这种修饰导致靶基因在不同癌细胞模型中的表达谱相反，并影响间充质基因CDH1、VIM1、TGFB1和凋亡标记物BCL2的表达。此外，甲基化诱导的表达谱变化还伴随着细胞迁移和细胞形态的表型转换。我们得出结论，在不同的细胞类型中，DNA甲基化对基因表达和细胞命运的影响可能完全不同。

介绍

越来越多的研究报告称，蛋白质不是孤立地起作用，而是一个复杂的生物分子网络的一部分，在不同的环境下可能会有所不同(例如，不同的肿瘤类型[1,2]或肿瘤进展阶段[3])。文献[4-7]中已经描述了各种具有相反作用的基因，例如在肿瘤发生过程中。DNA甲基化可能是这些对立角色的驱动因素之一。例如，相同的DNA甲基化标记可能导致截然相反的结果(胚胎活力与致死)，这取决于哪个等位基因被标记了这种修饰[8]。在这里，我们将测试相同的表观遗传修饰是否也可以协调非印迹基因的分子和表型多样性。

在本研究中，我们将重点关注胰岛素样生长因子结合蛋白2 (IGFBP2)，这是一个最近发现的由DNA甲基化调控的多任务基因，也被报道为肿瘤促进和抑制基因。IGFBP2是一种分泌蛋白，与IGF-1和IGF-2配体竞争IGF受体结合，从而调节IGF信号的下游级联，介导增殖和迁移等必要的细胞过程。一方面，它被描述为通过促进p53依赖性IGF-1和ERK失活从而导致增殖衰减的肿瘤抑制因子[9]。此外，它与TGFB1、SERPINE1和BCL2协同作用，已被证明可诱导细胞凋亡并阻断迁移[10]。另一方面，IGFBP2通过与整合素α5和β1的相互作用促进侵袭[11,12]，激活NFkβ-Zeb1[13]和EGFR/STAT3轴[14]，通过CD144和MMP2促进血管模拟[15]，诱导免疫抑制[16]，已被证明是一种致癌基因。

癌症驱动基因的单一改变导致的不同表型可能仅仅反映了这些基因在不同信号通路中的不同作用，但也可能是由这些基因的不同基因表达模式引起的。如雌二醇在MCF7细胞中上调IGFBP2的表达水平，而在R3230AC乳腺腺癌中下调IGFBP2的表达水平[17-19]。然而，当DNA甲基化水平保持不变(与激素情况类似)时，基因表达的其他调控机制，如DNA甲基化[20]，是否也会导致不同细胞类型中相反的表达模式，目前尚不清楚。DNA甲基化是一种重要的转录组调控机制，基于5 ' -甲基胞嘧啶化学基团占据CpG二核苷酸[21-23]。无论细胞类型如何，DNA甲基化对靶基因表达和细胞命运的影响是一致的，还是可以根据肿瘤细胞背景驱动相反的表型，这仍然是未知的，并且由于缺乏原位靶向DNA甲基化的技术，多年来一直难以捉摸。

在这里，我们利用CRISPR/Cas表观基因组编辑技术[24]，评估这种去新生表观遗传修饰对IGFBP2转录组调控和细胞可塑性的贡献。我们报道了对IGFBP2启动子的首次CRISPR/dCas9表观遗传编辑，显示了子细胞DNA甲基化的长期和真实遗传。我们的研究还强调，DNA甲基化的类似增量可以导致不同肿瘤细胞类型中靶基因表达的相反转录效应，并导致间充质基因和一种凋亡标记物的失调。此外，我们发现DNA甲基化可以诱导迁移和细胞形态的表型转换。

结果

通过CRISPR/dCas9/DNMT3ACD模块实现基因特异性DNA甲基化

为了在体外靶向特定的DNA甲基化位点，我们将失活的Cas9内切酶(dCas9，靶向结构域，p.D9A和p.H840A)融合到DNMT3ACD上。融合蛋白与基因组DNA的预测拴系如图1A所示。在Cas9序列的上游和下游放置两个核定位序列，以促进融合蛋白富集到细胞核中。为了选择表达dCas9-DNMT3ACD结构的阳性细胞，使用T2A连接器将eGFP荧光序列偶联到DNMT3ACD的3 '端。首先，我们通过瞄准Vojta等人(2016)报道的关于BACH2基因的精确差异甲基化区域(DMRs)来验证我们的系统(补充图1A)。焦磷酸测序证实DMR1中DNA甲基化的平均水平与先前报道的相同(补充图1B)。此外，DMR2的一些CpG位点达到了接近报道值的DNA甲基化峰值(例如，当使用对照sgRNA时，CpG1为6%，当使用sgRNA 3靶向BACH2启动子时为15%)。这一数据表明，我们针对特定甲基化位点的方法与之前报道的类似方法相当程度[25]。

图1:IGFBP2启动子的rna程序化DNA甲基化在有丝分裂细胞分裂过程中引入稳定和可遗传的标记。(A) dCas9蛋白与DNMT3ACD融合的预测结构，以及sgRNA序列引导下的dna锚定。Cas9蛋白的识别叶(RecI、II和III结构域)和核酸酶叶(HNH、RuvC和PI结构域)也有表达。(B) sgRNA向导在IGFBP2基因启动子区域的定位。被询问的两个CpG位点被标记为差异甲基化区(DMR)，并根据它们与转录起始位点(TSS)的距离进行放置。白色棒棒糖表示邻近的CpG位点。甲基特异性引物(MSP)定位。F/R(M)，甲基化区正向/反向引物;F/R(U)，未甲基化区的正向/反向引物。(C)焦磷酸测序分析，用于评估HEK293T细胞中的DNA甲基化，比较对照或igfbp2特异性导向的细胞。对单个和合并的sgRNA向导进行测试。(D)对照sgRNAs/dCas9-DNMT3A(活性)、特异性sgRNAs/dCas9-DNMT3A(活性)或特异性sgRNAs/dCas9-DNMT3A(非活性)构建体靶向的IGFBP2启动子区域CpG甲基化水平升高。(E) CRISPR/dCas表观遗传编辑和焦磷酸测序后预期和观察到的DNA甲基化模式示意图。用MSP(扩增子大小为102 bp)确认焦磷酸测序结果。F/R(M)，甲基化区正向/反向引物;F/R(U)，未甲基化区的正向/反向引物。(F)从转染群体中分离单个细胞以研究DNA甲基化稳定性的策略。用对照sgRNA引导池1-3(凝胶通道1和2)转染细胞获得MSP PCR扩增;IGFBP2特异性sgRNA向导3和6(凝胶通道3和4);细胞培养22天后，从目标细胞群(sgRNAs 3,6)中获得18个单克隆。示凝胶带密度测定。(G)对12个单对照克隆(来自汇集的sgRNAs 1-3细胞群)和12个单IGFBP2靶向克隆(来自图1G克隆1和7)进行长期DNA甲基化分析。lane 1-2(对照池sgRNAs 1-3)和lane 3-4 (IGFBP2靶向池sgRNAs 3、6)分别代表DNA甲基化的阴性对照和阳性对照。示凝胶带密度测定。

DNA甲基化 IGFBP2启动子在有丝分裂细胞分裂过程中是稳定的

利用我们的验证系统，我们评估了IGFBP2启动子的瞬时去novo靶向DNA甲基化及其在几轮有丝分裂细胞分裂中的稳定遗传。我们选择了7个靶向IGFBP2启动子CpG位点1和2的sgRNA序列(图1B)。DNA甲基化是针对这个特定区域，它代表p53的结合位点，p53是参与IGFBP2基因表达的转录因子之一。用dCas9-DNMT3ACD构建体转染HEK293T细胞，并使用抗标记抗体在蛋白水平上通过western blot检测预期大小(210 kDa)的条带来评估其表达(补充图2A)。为了靶向DNA甲基化，我们转染了dCas9-DNMT3ACD构建体和相应的sgRNA向导。转染5天后，根据eGFP的表达选择dcas9 - dnmt3acd阳性细胞(补充图2B)。焦磷酸测序显示，与对照sgrna相比，位于目标CpG位点上游或下游27 - 30bp窗口内的sgrna呈现更高的DNA甲基化增量(图1C)。特别是，单个sgRNAs 3和6在两个目标CpGs中管理着更高的DNA甲基化个体增量(高达40%)。有趣的是，sgRNAs 3和6或3和7的组合以头对头的方向靶向感兴趣的区域，表现出最高的DNA甲基化效率(高达60%)，这表明sgRNAs的组合对于更有效的靶向至关重要(图1C)。在同一基因组位点上进行亚硫酸氢盐测序验证了焦磷酸测序数据，并揭示了当DNMT3A酶的活性形式被拴在目标区域时，DNA甲基化的明显增加(图1D，补充图3A)。此外，亚硫酸酯测序证实了先前报道的观察结果[25]，亚硫酸酯测序显示DNA甲基化峰发生在dCas9结合的侧翼区域，距离PAM序列27 - 30bp(图1D，补充图3A)。

为了测量DNA甲基化遗传的稳定性，我们为我们感兴趣的区域建立了甲基化特异性引物(MSP)测定。与焦磷酸测序方法相比，该技术允许以最小的成本分析大量样品。首先，MSP测试证实，DNA甲基化不是在目标区域的远端下游CpG位点获得的，而是在被询问的CpG位点获得的(图1E)，支持焦磷酸测序数据。为了量化甲基化，我们利用下游CpG位点始终保持未甲基化的事实，并使用未甲基化特异性的反向引物进行了所有MSP PCR扩增。当转染非特异性sgRNAs时，被询问的CpG位点保持未甲基化，而合并的sgRNAs 3和6提供了与焦磷酸测序和亚硫酸盐测序检测到的DNA甲基化水平一致的MSP PCR扩增模式(图1E)。

为了确定de-novo表观遗传标记的遗传，我们对合并对照sgRNAs 1-3和sgRNAs 3、6细胞群体进行eGFP分类，分离单细胞，获得无性系(图1F)。经过22天的细胞分裂和几轮细胞分裂，克隆MSP PCR扩增结果显示，大多数以sgRNAs 3和6为靶点的单克隆仍保持甲基化(77.8%，18个克隆中有14个)(图1F)。对两个随机选择的克隆进行亚硫酸氢盐测序，验证了MSP结果，证实了培养22天后目标区域的高甲基化(补充图3B)。此外，为了进一步表征该靶向表观遗传标记的长期遗传特性，随机选择两个CRISPR/dCas IGFBP2靶向克隆群体(1和7)进行扩增，并通过分选作为单克隆再次播种。再扩增22天后，每种条件下对12个衍生克隆的分析表明，在大多数以sgRNAs 3和6为靶点的查询克隆群体中，DNA甲基化完全保留(图1G)。亚硫酸氢盐测序证实，在随机选择的一个克隆中，DNA甲基化长期完全保留(88%)，在培养44天后，另一个克隆中DNA甲基化部分保留(25%，补充图3C)。我们的数据表明，CRISPR/dCas-DNMT3ACD系统以60-89%的效率促进了IGFBP2基因的特异性启动子甲基化，并且在活跃分裂的HEK293T细胞中，其保留持续了几轮群体倍增。

靶向DNA甲基化 IGFBP2启动子修饰mRNA水平

在证明IGFBP2启动子是表观遗传可编辑的之后，我们接下来质疑这是否会对转录水平产生任何影响。我们比较了基于三种单一非靶向控制sgrna(独立使用或作为一个池使用)的四种控制条件，以及两种不同的靶向sgrna组合(sgRNAs 3和6;和sgRNAs 3和sgRNAs 7)。正如预期的那样，通过增加甲基化水平，我们观察到当活性DNMT3A构建体特异性靶向IGFBP2基因位点时，IGFBP2基因的转录水平显著降低(图2A)。IGFBP2启动子的甲基化并未导致EMT调控基因CDH1、VIM1或TGFB1的转录失调。然而，我们发现凋亡标志物BCL2的差异表达取决于IGFBP2启动子的甲基化水平(补充图4A)。综上所述，在HEK293T细胞中，IGFBP2启动子的靶向DNA甲基化影响其自身转录和BCL2凋亡调控基因的表达水平。

图2:CRISPR/dCas靶向IGFBP2启动子DNA甲基化影响癌细胞中基因转录和EMT转录组学。(A) qPCR分析IGFBP2基因在HEK293T细胞中的表达。NTC:非靶向控制，DT:直接靶向控制，INC: DNMT3A无活性控制。比较了3-4个独立的生物重复[包括对照群体(单个或合并对照sgRNAs 1-3)和2个独立的IGFBP2靶群体(sgRNAs 3、6和3、7)]。使用第一控制基因和管家基因B2M和PPIA对数据进行归一化(误差条表示标准差)。个体p值采用Tukey多重比较检验。(B)对H3122和MCF7细胞进行DNA甲基化评价的Pyrosequencing分析，比较对照或igfbp2特异性指南3和6靶向的细胞。(C) qPCR分析IGFBP2在H3122和MCF7细胞中的表达。使用第一个控制和管家基因B2M对数据进行归一化(误差条表示两个独立生物重复的标准差)。(D) Western blot和密度测定显示CRISPR/dCas编辑后的IGFBP2在H3122和MCF7细胞中的表达。(E)左图，从转染了对照sgRNAs 1-3或igfbp2特异性指南3和6的MCF7细胞中分离单个克隆的策略。通过焦磷酸测序(右图)评估每种条件下的所有衍生克隆的DNA甲基化水平。p值采用Mann-Whitney检验。(F) IGFBP2全异构体(上图)和IGFBP2 1异构体(下图)的表达在每个条件下的所有单克隆中进行评估。对2个独立的生物重复进行统计[包括7个独立的对照克隆(pooled control sgRNAs 1-3)和10个独立的IGFBP2靶向克隆(sgRNAs 3,6)]。使用第一控制基因和内务基因B2M和PPIA对数据进行归一化处理(误差条表示标准差)。(G) qPCR分析评估MCF7克隆中间充质基因(CDH1、VIM1、TGFB1)和凋亡标志物BCL2的表达。使用来自两个独立生物重复的数据进行比较(包括7个独立的单克隆转染了混合对照sgRNAs 1-3和10个独立的单克隆转染了igfbp2特异性sgRNAs 3和6)。数据使用第一对照和管家基因B2M和PPIA进行归一化(误差条表示SD)。经log2数据转换后，采用单样本t检验进行qPCR统计分析。双尾p值≤0.05、≤0.01或≤0.001被认为具有统计学意义，并分别用星号(*、**或***)表示。

的DNA甲基化增益 IGFBP2启动子增加上皮样肿瘤细胞中间充质样基因的表达水平

为了研究靶向IGFBP2启动子DNA甲基化对细胞可塑性的影响，我们在两种上皮肿瘤细胞系(H3122和MCF7)中进行了类似的实验。H3122是肺腺癌细胞系，MCF7细胞是乳腺癌细胞系。首先，我们在H3122和MCF7细胞系中分别获得了43.8%和73.7%的DNA甲基化显著增加(图2B)。亚硫酸氢盐测序证实了这些结果，H3122和MCF7的甲基化水平分别为50%和86%(补充图4B和4C)。这种表观遗传编辑导致IGFBP2基因转录水平显著失调。令人惊讶的是，与我们在HEK293T细胞中观察到的相反，在这些上皮肿瘤模型中，用位点特异性sgRNAs靶向CRISPR/dCas后，mRNA和蛋白水平显著上调(图2C和2D)。

这一令人惊讶的观察结果与基因启动子上的DNA甲基化下调基因表达的权威观点相矛盾，为了进一步研究这一发现，我们使用一批新的MCF7细胞重复了表观遗传编辑。在这些细胞中，我们将失活的DNMT3A构建物作为额外的对照。首先，我们注意到，与旧批细胞相比，新批细胞在IGFBP2位点显示出显著的低基础DNA甲基化水平(0% vs 22%，补充图4B和5A)，突出了同一细胞类型内的表观遗传差异。通过使用活性DNMT3A和非特异性引导物或非活性DNMT3A和位点特异性引导物靶向IGFBP2位点，我们观察到背景甲基化的适度增加(38%)，与旧批次相当。然而，使用活性结构和位点特异性向导的直接靶向使DNA甲基化增加了69%(补充图5A)。这表明该位点在新一批细胞中是表观遗传可编辑的，但也揭示了DNA甲基化的获得比使用旧一批细胞的效率低近20%。正如我们最初预期的那样，mRNA表达数据显示，在新的MCF7批次中，使用活性DNMT3A进行表观遗传编辑后，IGFBP2不显著但一致下调(补充图5B)。重要的是，细胞检查确认了本研究中使用的所有细胞系和批次，并确认了它们的可疑来源(补充图5C)。总的来说，我们的数据表明，DNA甲基化的基础水平和CRISPR/dCas9/DNMT3A靶向的效率可以决定下游转录效应。

我们在两个独立的肿瘤细胞系(H3122和MCF7)中观察到IGFBP2通过DNA超甲基化而上调，这引起了我们的兴趣，我们继续更详细地探索了IGFBP2 mRNA上调最高的老MCF7批。首先，我们仔细研究了IGFBP2 mRNA亚型。IGFBP2基因包含四个mRNA亚型，但只有亚型1 (NM_000597)与目标CpG岛重叠。此外，为了揭示细胞异质性是否导致了这些意想不到的结果，我们对7个(pooled sgRNAs 1-3)和10个(pooled IGFBP2 sgRNAs 3和6)MCF7单细胞克隆进行了分析。单个克隆的焦磷酸测序分析证实，当CRISPR/dcas9/DNMT3A靶向IGFBP2启动子区域时，存在明显的DNA甲基化富集(图2E)。重要的是，qPCR数据显示，在大多数测试的克隆中，DNA甲基化的增加与IGFBP2亚型1(更普遍的亚型)的上调特异性相关(图2F)。异构体2、3和4也进行了分析，但表达水平非常低甚至不存在，并且在克隆之间没有差异(数据未显示)。因此，对照和靶向克隆之间mRNA表达水平的差异主要是IGFBP2亚型1的表达。

利用已有的证据表明IGFBP2可以影响EMT的转录水平[26]和凋亡标记物[10]，我们对MCF7细胞系的单克隆进行了研究，并证实了这种表观遗传修饰对EMT和凋亡相关基因在IGFBP2超甲基化过程中的转录水平的显著影响。IGFBP2高甲基化导致CDH1下调，VIM1和TGFB1基因上调(图2G)。此外，IGFBP2高甲基化也诱导了BCL2基因的上调(图2G)。

为了测试CRISPR/dCas的非特异性结合效应，我们对本研究中最常用的导向基因(sgRNAs 3和6)进行了脱靶基因分析。大多数脱靶候选基因(FAM184B、QSOX2、SPATC1L、FBRSL1、GATA4、TERT、CD24、ATAD3AB)在靶向克隆和非靶向克隆之间的表达没有任何差异(图3A)。然而，我们的CRISPR/dCas表观遗传编辑明显上调了一些排名靠前的脱靶基因(VILL, SHC2, KDM4B)(图3A)。为了测试这些基因的上调是否可能是脱靶甲基化的结果，我们对属于组蛋白去甲基化酶KDM4B/JMJD2B的脱靶区域之一进行了亚硫酸盐测序。令人惊讶的是，该分析显示KDM4B/JMJD2B基因脱靶区(位于内含子18的3 '端)的9个CpGs中有4个的DNA甲基化水平降低(图3B)。总体而言，13个脱靶候选区域中有2个(15%)的转录水平发生了显著变化，其中一个候选区域获得的亚硫酸盐测序数据表明，这可能是由非特异性CRISPR/dCas结合直接介导的。

图3:脱靶分析发现了CRISPR/dCas靶向的一些间接影响。(A) qPCR分析评估IGFBP2 sgRNA指南3和6中CRISPR/dCas脱靶基因的表达。比较了2个独立的生物重复[包括3个独立的对照克隆(转染了合并对照sgRNAs 1-3)和3个独立的IGFBP2靶向克隆(转染了sgRNAs 3和6)]。使用第一控制基因和管家基因B2M和PPIA对数据进行归一化(误差条表示标准差)。经log2数据转换后，采用单样本t检验进行统计分析。双尾p值≤0.05、≤0.01或≤0.001被认为具有统计学意义，并分别用星号(*、**或***)表示。(B)与KDM4B基因连接的脱靶候选区域的亚硫酸盐测序。每条竖线表示一个询问区域内的CpG位点。亚硫酸氢盐基因组测序在≥12个个体克隆中进行。甲基化或未甲基化的胞嘧啶分别用黑色或白色方块表示。灰色方块表示CpG区域外未转化胞嘧啶的CpG位点，因此它们不用于DNA甲基化的估计(用数字，%表示)。带有星号的竖线表示DNA甲基化降低的CpG位点。

DNA甲基化 IGFBP2启动子改变MCF7细胞形态，增加细胞迁移速度

由于IGFBP2启动子DNA甲基化导致与迁移相关基因的表达改变，我们测试了它是否对这一过程具有功能影响。因此，我们建立了延时实时成像并表征了igbfp2表观遗传编辑的上皮癌细胞系MCF7与对照组相比的迁移行为。本实验对3个池式sgRNAs 1-3对照克隆和3个IGFBP2池式sgRNAs 3和6克隆进行检测。我们对细胞进行了14小时的成像，并手动跟踪每个细胞的位置。如图4A和4B中的玫瑰图所示，IGFBP2靶向克隆的迁移速度明显快于对照克隆。对细胞表面的详细分析表明，所有IGFBP2靶向克隆都经历了细胞形态的转变，细胞突起的数量和长度显著增加(图4C和补充视频1-4，白色箭头)。总的来说，这些结果与转录组学数据一致，支持IGFBP2基因的表观遗传编辑在乳腺上皮癌细胞系MCF7中驱动更具迁移性的表型的观点。

图4:高分辨率成像显示，经过CRISPR/dCas IGFBP2表观遗传编辑后，上皮细胞系MCF7克隆的迁移速度增加。(A)显示3个池化控制sgRNAs 1-3克隆和3个池化IGFBP2 sgRNAs 3和6克隆的9条独立迁移轨迹。(B) 3个池化对照sgRNAs 1-3克隆和3个池化IGFBP2 sgRNAs 3和6克隆的迁移速度分布。误差条表示n = 3-9个独立位置的标准差。速度和位移采用Mann-Whitney U检验，有丝分裂细胞分裂分析采用t检验。P值≤0.05、≤0.01或≤0.001被认为具有统计学意义，并分别用星号(*、**或***)表示。(C) 3个汇集的对照sgRNAs 1-3克隆和3个汇集的IGFBP2 sgRNAs 3和6克隆的代表性延时图像。白色箭头表示细胞突起的外观(对照组中没有)。图像显示核标记物(H2B-dendra2)跟踪细胞分裂和迁移，膜标记物(mTurquoise-2和mVenus)研究细胞形态。

讨论

在这项研究中，我们揭示了DNA甲基化对IGFBP2表达的影响，并对DNA甲基化本身的过程有了一些基本的了解。CRISPR/dCas/DNMT3ACD技术对IGFBP2启动子位点的精确编辑表明，靶向感兴趣区域邻近位点的头对头定向sgrna的组合使甲基化水平更高。我们的数据还表明，DNA甲基化的最大峰值出现在距离PAM序列27 - 30 bp的位置，而甲基化效率在距离PAM序列35 bp后开始下降，这与之前的结果一致[25,27]。此外，我们提供的证据表明，由CRISPR/dCas表观遗传编辑引入的DNA靶向甲基化由子细胞遗传，并在多次细胞分裂中保持稳定。据我们所知，迄今为止还没有研究报道，通过进行克隆实验，暂时诱导的CRISPR/dCas编辑的DNA甲基化是否能稳定地从亲代细胞传递到子代细胞。先前有几篇出版物报道，CRISPR/dCas-DNMT3ACD技术引入哺乳动物基因组的单DNA甲基化变化很快丢失，这表明存在细胞对抗机制来保留细胞特异性DNA甲基化指纹[25,27]。在这里，我们通过研究这种表观遗传标记在许多轮有丝分裂细胞分裂中的克隆遗传，显示了DNA甲基化从亲代到子代细胞传递的实质性稳定性。我们的研究结果表明，编辑的表观遗传标记在子细胞的基因组中稳定地保存了超过48次细胞分裂，这些细胞分裂发生在细胞培养的一个多月内。有趣的是，这些结果与最近发表的一篇文章一致，该论文描述了通过短暂使用CRISPRoff系统来实现脱氧DNA甲基化的程序化长期遗传[28]。然而，我们不能排除在其他基因组区域而不是启动子中，如重复元件序列或基因间区域，异位DNA甲基化标记的保留可能遵循不同的动态。事实上，最近的报道表明，启动子区域在DNA甲基化方面得到了更好的保存，而非功能区，如含有重复元件的区域，显示出更高的(epi)方差[29]。

我们的研究也为IGFBP2的表达调控提供了新的见解。IGFBP2是一种具有细胞外和细胞内功能的多任务蛋白。该癌基因最初被描述为p53介导转录的直接靶标，可阻断磷酸化erk表达的激活，从而抑制IGF-I信号传导[9]。最近，许多研究发现IGFBP2是emt驱动基因，通过E-cadherin抑制促进结直肠癌细胞的增殖和迁移[30]，或通过激活NF-κB-ZEB1信号轴促进肝细胞癌的进展[13]。在胶质母细胞瘤中，IGFBP2通过失衡EGFR-STAT3信号和增强STAT3磷酸化来影响无数不同的分子网络并塑造肿瘤进展[14]，将整合素和NF-κB信号与细胞迁移联系起来[31]，并通过表达血管内皮钙粘蛋白CD144和MMP2促进肿瘤细胞向内皮细胞的反分化(血管生成模拟)[15]。这些文献表明，必须严格调节该基因的表达，以保证其正确的功能。IGFBP2水平受激素、蛋白酶活性、缺氧以及最近显示的启动子DNA甲基化的调节[32]。在这里，我们发现IGFBP2的表达也可以通过靶向DNA甲基化来调节。

启动子区域的靶向甲基化被认为会导致这些基因的表达减少[33]。在这里，我们研究了IGFBP2启动子靶向甲基化的结果，并表明该启动子的甲基化导致该基因在不同细胞类型和批次中产生相反的转录效应。在HEK293T细胞中，只有7%的基础DNA甲基化，我们发现IGFBP2启动子的两个特定CpG位点的脱氧DNA甲基化与IGFBP2的表达水平之间存在强烈而显著的负相关。在新一批MCF7细胞中获得了类似的观察结果，在询问的CpG位点上显示0%的基础DNA甲基化。令人惊讶的是，在另外两种细胞设置(H3122和旧批次MCF7)中，我们发现更高水平的基础DNA甲基化(~25%)，并且在mRNA和蛋白质水平上，脱氧DNA甲基化与IGFBP2表达呈正相关。我们的亚硫酸盐测序和表达数据表明，野生型细胞中IGFBP2位点DNA甲基化的差异基础水平与表观遗传编辑后相反的表达结果相关。这表明甲基化的基础水平可以决定来自表观遗传编辑的转录结果。

在旧批MCF7细胞上进行的IGFBP2 mRNA亚型的细胞克隆分析证实了上述结果，另外的基因表达测量显示DNA甲基化的增加、上皮标记物CDH1的下调和EMT基因VIM1和TGFB1的上调之间存在显著的正相关。据我们所知，这是第一个证明IGFBP2启动子的DNA甲基化对间充质样标记物表达水平有影响的报告。通过CRISPR/dCas IGFBP2 DNA甲基化，我们观察到在所有被调查的克隆中CDH1的表达显著下调，VIM1和TGFB1的表达上调。此外，我们发现表观遗传靶向MCF7克隆的形态、迁移和生长模式发生了严重改变。TGFB1对雌激素受体阳性细胞系如MCF7生长的影响是众所周知的，我们的研究结果也支持了这一点[10]。在本研究中，我们还发现DNA甲基化在影响IGFBP2表达水平的同时，在两种不同的肿瘤细胞系模型(HEK293T和MCF7)中也会使BCL2表达失衡。有趣的是，这两个基因的共同之处在于它们属于两个强大的抗凋亡系统(IGF-1和促生存的bcl2样蛋白)，并且它们的相互调节在之前已经被报道过[34]。

总之，我们的研究通过揭示表观遗传编辑对转录组调控和肿瘤细胞行为的重要影响，强调了探索表观遗传编辑在不同肿瘤环境中的作用的重要性。

材料与方法

CRISPR/dCas9-DNMT3ACD融合蛋白和sgRNAs设计

为了在体外靶向特定的DNA甲基化，我们专注于Vojta等人(2016)先前描述的系统。人DNMT3A(氨基酸)催化结构域P602-V912;其中，DNMT3ACD)与失活的SpCas9融合(上游)，从质粒pdCas9-DNMT3A-eGFP(添加基因质粒#71666)中获得T2A-eGFP编码序列(下游)。编码序列的两个替换(D10A和H840A)消除了该内切酶的酶切活性。编码序列以三重标记开始，然后是SV40核定位信号。在dCas9和DNMT3A序列之间放置了一个附加的帧内NLS序列，带有短Gly4Ser连接子。用限制性内切酶AgeI和NotI酶切，克隆到先前用XbaI和EcoRI酶切的Addgene质粒#63592中，用EF-1alpha启动子替代CMV启动子。使用来自NEB(参考文献M0202)的T4连接酶进行过夜培养后，添加两个50-60 bp的接头进行最终连接。矢量序列可以在补充资料1中找到。

利用Breaking-Cas网络工具设计靶向感兴趣位点的引导序列[35](http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/breakingcas)。只有20个核苷酸长度指南与NGG PAM序列，达到85分以上(100分)。从human GeCKOv2文库中提取了3个与人类基因组不匹配的非靶向控制引导rna[36]。将正、反向引物重新悬浮在水中至100 μM。各引物各2.5 ul加入120 μl退火缓冲液(100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.5)中。PCR程序如下:95°C 5分钟，14个循环(每个循环温度降低5°C，直到达到25°C)，最后一步在25°C下20分钟。sgrna见补充表1A。

细胞转染

人胚胎肾细胞系HEK293T、H3122和MFC7在添加10%胎牛血清、1%丙酮酸钠(H3122细胞)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的Dulbecco 's Modified Eagle培养基(#21885-025,Invitrogen)中维持。细胞在37°C的5% CO2加湿环境中孵育。

细胞转染时，将细胞以80-90%的合流率接种于6孔板，24小时后用Lipofectamine 2000转染细胞，方法如下:将质粒(dcas9 - dnmt3 - egfp质粒3 μg和sgRNA引导质粒1 μg)混合在150 μl的Optimem培养基中。在需要联合用药的情况下，我们使用等量的sgRNA，每种sgRNA的总剂量不超过1 μg。同时，将10 μl Lipofectamine 2000稀释于150 μl Optimen培养基中，室温孵育5 min，然后将质粒混合物加入到Lipofectamine稀释液中，室温孵育20 min。最后，用2 ml预热好的DMEM+10% FBS培养基更新细胞，滴注转染混合物。24小时后，收获细胞，加入1.5 μg/ml的嘌呤霉素，将细胞转移到10 cm的培养皿中，以丰富表达sgRNA导向的细胞群体。选择时间为48小时。之后，用培养基更新细胞培养，并在培养中保持两天。最后，收集细胞并进行eGFP-FACS。

流式细胞仪分选

细胞重悬于含有2mm EDTA和2% PBS中FBS的FACS缓冲液中，在Aria Fusion (BD Biosciences)中进行细胞分选。一个宽的FSC/SSC门之后是排除双峰和选择topro3活细胞的门。采用严格门控法分离eGFP+肿瘤细胞。

DNA甲基化分析

采用适用于细胞数量较少的苯酚-氯仿法提取细胞DNA。简单地说，从FACS中回收的细胞在600 μl裂解缓冲液(10 mM Tris-HCl pH7.4, 10 mM EDTA, 200 mM NaCl, 1%SDS)和15 μl蛋白酶K (10 mg/ml)中重悬。样品在37℃下孵育过夜(ON)。ON孵育后，在75℃下失活蛋白酶K 15 min，然后加入2 μl RNAse (10 mg/ml)。37℃孵育30 min后，加入620 μl苯酚:氯仿:异苯胺(25:24:1)，室温下旋转混合10 min。在12,000 g(4°C)下离心30 min后，将其放入新管中，与等体积的变色峰在室温下混合5 min。在12,000 g(4°C)离心15 min后，将急性相放入新管中，加入1/10体积的NaAc (3M)混合。然后，加入等体积的异丙醇和50 μl/ml的糖蓝(Ambion, AM9515)，室温下混合5min。样品保存在-20°C ON。最后，样品在12,000 g(4°C)下离心30分钟，并用70%的乙醇洗涤两次。

按照制造商的说明，使用EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Research)对100-1000 ng基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化。基因组DNA的转化使用EZ DNA甲基化金试剂盒(Zymo Research, Orange, CA, USA)和Bibikova等人(2009)的变性条件(初始变性步骤在98°C下10分钟，在98°C下30秒和50°C下1小时进行16个循环)。DNA甲基化通过焦磷酸测序研究，该测序是在从细胞中提取的亚硫酸根处理的DNA上进行的。在PyroMark Q24 System version 2.0.6 (QIAGEN)上进行焦磷酸测序反应和DNA甲基化定量，包括适当的对照。使用PyroMark Assay Design Software (QIAGEN-version 2.0.01.15)设计特异性引物进行焦磷酸测序，以检测覆盖候选基因启动子区域的特定CG位点的甲基化状态。焦磷酸测序引物如补充表1B所示。

亚硫酸氢盐序列分析，亚硫酸氢盐转化DNA被用作PCR反应的模板。BS引物如补充表1C所示。使用Immolase Taq (Bioline)运行PCR程序，并调整到最大限度地扩增PCR产物而不达到饱和点:95°C初始变性步骤8分钟，31个循环(95°C 30秒，59°C 30秒，72°C 25秒)，最后延长72°C 1分钟。从琼脂糖凝胶中纯化出519 bp的PCR条带并克隆到PGEM-T (Promega)载体中。通过IPGT和X-gal筛选含有插入物的dh5 - α细菌菌落(白色菌落)，测序证实整合正确。

对于MSP分析，亚硫酸氢盐转化的DNA被用作PCR反应的模板。使用MethylExpress®程序(Applied Biosystems)设计非甲基化和甲基化区域的特异性引物。MSP引物如补充表1D所示。每个引物的3′端含有2 ~ 3个CpG位点。PCR程序使用GoTaq®G2 Hot Start Green Master Mix (Promega, M7421)运行，并调整以最大限度地扩增PCR产物而不达到饱和点:在95°C下初始变性步骤8分钟，31个循环(95°C 30秒，59°C 30秒，72°C 25秒)，最后延长72°C 1分钟。与焦焦测序相比，这种方法允许以最小的成本分析大量样品。

表达分析

qRT-PCR实验采用Trizol®试剂提取总RNA，使用Kit High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(参考文献4368814)逆转录1 ug。采用PowerUp SYBR Green (A25741)进行实时PCR，使用PPIA、B2M和TBP作为内务基因进行归一化。引物浓度为150 nM，序列注释见补充表1E。使用RDML- ninja和LinReg软件对RDML原始数据进行处理，确定基线并获得经验引物效率。通过ΔΔCt计算得到样品之间的qPCR折叠变化，并通过引物效率进行校正。计算两个管家基因的平均值，进行log2变换并绘制。采用GraphPad Prism软件包，采用单样本t检验计算统计学显著性。在免疫印迹检测中，总蛋白采用Laemli 1X (60 mM Tris-HCl, 2% SDS, 10%甘油，0.01%溴酚蓝)提取，以快速保存所有蛋白磷酸化位点的完整性。针对目标蛋白的特异性抗体列于补充表1F中。

延时共聚焦成像

为了表征表观遗传编辑细胞的动态行为，使用了MCF7乳腺癌模型的6个单克隆(3个合并的sgRNAs 1-3对照克隆和3个IGFBP2合并的sgRNAs 3 - 6克隆)。为此，每个克隆都与细胞膜标记(基于MARCKS结构域)和核标记(基于H2B-dendra2报告基因)共转导。为了区分对照克隆和IGFBP2靶向克隆，前者用marks - mturquoise2荧光团转导，后者用marks - mvenus荧光团转导。矢量序列可以在补充材料1中找到。采用徕卡共聚焦SP5倒置显微镜，25倍水浸物镜(N.A. 0.95)进行延时拍摄。简而言之，在8-ibidi玻璃底腔中，每孔平板2000个细胞，并保持在自己的培养基中，防止水分漂移，并通过使用Okolab CO2腔保证CO2供应。每12分钟拍摄一次图像，总共拍摄了大约14个小时。使用Fiji软件对图像进行后期处理。使用Chemotaxis and migration Tool V2.0 (Ibidi)在斐济检索XY坐标后获得细胞迁移轨迹显示、速度和位移值。采用SPSS软件包进行统计学分析，采用KS和SW正态性检验和Mann-Whitney U检验(细胞迁移速度和位移)，独立样本采用t检验(细胞分裂)。

CRISPR/dCas9脱靶分析

使用Breaking-Cas web-tool软件包[35](http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/breakingcas)获得IGFBP2 sgRNAs 3和6的CRISPR/dCas9脱靶候选基因。在补充表2A和2B中标注了脱靶候选区域。我们使用NCBI浏览器(GRCh38)从20 bp的脱靶序列中检索每个候选基因组序列，包括500 bp(上游和下游)。然后，使用MethylExpress软件单独询问每个序列是否存在富集的CpG区域。与(部分)CpG岛相关的脱靶候选区域相关的基因通过qPCR进一步表征，将三个对照池sgRNAs 1-3克隆与三个IGFBP2池sgRNAs 3和6克隆进行比较，这些克隆的细胞可塑性基因失调最为显著。引物列于补充表1D。脱靶候选基因KDM4B的亚硫酸氢盐序列也按照前面的描述进行。BS引物列于补充表1C。

作者的贡献

MV对研究进行了概念化和方法设计，并进行了实验和数据分析。MV和JvR参与了稿件的撰写、审阅和编辑。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

致谢

作者要感谢van Rheenen小组成员批判性地阅读这篇手稿。这项工作得到了欧洲研究理事会(整合者拨款648804给JvR)、约瑟夫·施泰纳博士基金会(给JvR)和EMBO ALTF 437-2017 (MV)奖学金的支持。

利益冲突

作者没有需要声明的利益冲突。