主要

真皮dc向传入lv的稳态迁移受到多种促迁移因子的严格调控，包括CCL21-CCR7趋化因子轴和粘附分子LYVE-1、CD99和JAM-A1、2,5,6,7,8,9,10,11,12。在LN中，~24小时的昼夜节律影响淋巴细胞的归巢能力和功能4,13,14,15,16；然而，白细胞从组织中排出是否以有节奏的方式发生尚不清楚。

为了解决这个问题，我们在一天中的不同时间(即授时数时间1 (ZT1；光照12h /黑暗12h，光照后1h；ZT7（‘白天’）、ZT13（‘晚上’）和ZT19（‘夜晚’）)，在培养基中培养6h。然后，我们通过免疫荧光成像量化了LYVE-1+皮肤淋巴中组织内源性CD11c+ dc的位置（图1a和扩展数据图1a，b）。CD11c+细胞向lv的浸润在ZT7（白天）达到峰值，在ZT19（夜间）达到低谷（图1a和补充表1）。在ZT1、ZT7、ZT13和ZT19稳定状态下，对耳朵中CD11c+ dc的位置进行进一步量化，而不进行后续培养，证实了白天淋巴内细胞的存在强于夜间（扩展数据图1c）。在ZT7和ZT19收集并培养24 h的外植体，在ZT7的LVs中CD11c+的浸润率仍然高于ZT19（图1b和扩展数据图1b），表明夜间迁移没有赶上白天迁移。局部应用异硫氰酸荧光素（FITC）（一种炎症刺激）后，也检测到CD11c+ DCs向lv的昼夜迁移（图1c），表明炎症期间迁移差异保持不变。在所有时间点，分析的细胞数量和左室总体体积相似（扩展数据图1d，e）。

图1：真皮dc向皮肤淋巴管的迁移是昼夜节律的。
figure 1

a,b， LVs中6小时(a)或24小时(b)后耳CD11c+细胞的Crawl-in检测；n = 3只小鼠，单因素方差分析（ANOVA），采用Tukey’s后检验(a)和未配对的Student’s t检验(b)。c， FITC涂抹24小时后LVs中的Ear CD11c+ DCs；2个独立实验N = 5只；采用Sidak后检验的双向方差分析。d， LVs中耳CD11c+细胞在亮：暗（LD）、暗：亮（DL）或恒暗（DD）下的爬行入试验；N = 3只；单向方差分析。e，耳朵爬行实验后的CD11c+langerin - DCs；N = 3只；非配对学生t检验。f，流式细胞术检测小鼠耳和培养液CD11c+MHCII+ CD103-EpCAM - cDC2s；N = 3只；双向方差分析。g，经过3小时的爬行检测后耳骨髓源性dc （bmdc）的定位；N = 3只；Tukey后验单因素方差分析。h，经过1小时的爬行检测后耳朵BMDCs的定位；N = 4只；非配对学生t检验。i，耳朵爬行试验中BMDCs的速度和方向；N = 217和301个细胞，分别来自4个独立实验的4只小鼠；非配对学生t检验；AU，任意单位。j，覆盖在lv（虚线，左）和坐标（右）上的BMDCs的迁移轨迹（蓝色，左）；N =来自4个独立实验的4只小鼠的34个细胞。k，不同昼夜节律（CTs）下BMDC与血清同步。1、脂多糖（LPS）激活的Per2:Luc BMDCs与血清同步后的生物发光振荡。m， 3小时后的同步BMDCs（非同步对照用虚线表示）。CT18/CT42为双标绘，方便观察；N = 4只；Tukey后验单因素方差分析。n、爬入检测后CT24和CT36同步bmdc的定位；N = 4只；非配对学生t检验。o，爬行检测后CT24和CT36同步bmdc的定位；n = 4个非同步bmdc和n = 6个同步bmdc；Tukey后验单因素方差分析。p，同步BMDCs在胶原迁移实验中的速度；N = 3只；Kruskal-Wallis测试和Dunn的后测。比例尺，100µm。数据至少代表两个独立的实验（a, b, d-h, m-p）。所有数据均以mean±s.e.m表示。

源数据

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昼夜节律是由其在没有外部干扰因素（如有节奏的光线开始和抵消）的情况下的持久性所定义的。为了研究DC向lv迁移的振荡是否具有昼夜节律性，将小鼠置于恒定的黑暗环境中。在持续黑暗的条件下，LVs中CD11c+ DCs在ZT7（白天）的峰值和ZT19（夜晚）的低谷之间的迁移差异继续存在，表明这些振荡是真正的昼夜节律（图1d）。振荡调整为12小时的倒置光暗周期（图1d），表明它们可以被光相移和携带，这是昼夜节律的另一个特征。这表明CD11c+ DC向皮肤lv的迁移是由内源性昼夜节律驱动的，而不仅仅是对有节奏的昼夜环境的反应。

耳朵原位全贴壁染色发现，与ZT19（夜间）相比，CD11c+朗格素- cd103 -真皮常规dc （cDC2s）和CD11c+朗格素+朗格汉斯细胞（lc）在ZT7（白天）优先迁移到lv中，而很少检测到CD11c+朗格素- cd103 + cDC1s（图1e和扩展数据图1f，g）。流式细胞术检测在ZT7和ZT19时从皮肤迁移到培养基中的CD11c+MHCIIhi细胞（图1f和扩展数据图1h-j）进一步表明，真皮CD103-EpCAM - dc和CD103-EpCAM + lc以高度依赖时间的方式从皮肤迁移，在ZT7（天）达到峰值。

为了从细胞自主过程中梳理出微环境的作用，我们在体外生成了几批lps激活的BMDCs17。生物钟在培养中是不同步的，因此BMDCs在种群水平上没有昼夜节律18。将BMDCs添加到在ZT1、ZT7、ZT13和ZT19采集的裂耳上3小时，这些裂耳来自放置在光照方案间隔6小时的光柜中的小鼠，从而能够在一天中的四个不同时间同时采集耳朵（扩展数据图2a）。通过定量免疫荧光成像检测，我们发现与ZT19（夜间）耳相比，ZT7（白天）耳的淋巴毛细血管中标记白细胞的数量增加（图1g和扩展数据图2b，c）。皮肤移植体中转移的BMDCs数量和左室体积在不同时间点之间没有差异（扩展数据图2d）。当BMDCs -皮肤外植体培养时间（迁移时间）缩短至10-60 min时，我们仅在ZT7（天）穗检测到BMDCs在LVs附近的积累（图1h和扩展数据图2e），表明日迁移差异发生在早期。此外，皮肤外植体的实时成像显示，与添加到ZT19（夜间）耳上的BMDCs相比，添加到ZT7（白天）耳上的BMDCs表现出更高的速度和方向性，以及增加的总距离和欧氏距离（图1i，j，扩展数据图2f，g和补充视频1和2）。这些观察结果表明，耳朵微环境控制着BMDCs的迁移能力。

为了评估昼夜节律对dc的影响，lps激活的BMDCs来源于表达昼夜节律蛋白PER2和荧光素酶（PER2 - luc）19融合蛋白的小鼠，用含有50%血清（“血清休克”）的培养基处理（图1k）18,20,21,22，同步PER2 - luc表达（图1l），而不影响细胞活力（扩展数据图2h）。将同步后24小时和36小时收集的BMDCs（分别为CT24和CT36）添加到ZT7小鼠的分裂耳朵上，PER2-Luclo CT36 BMDCs（白天BMDCs）比per2 - lucchi CT24 BMDCs（夜间BMDCs）更有效地迁移到皮肤外植体的传入淋巴中（图1m）。当PER2-Luclo CT36同步和PER2-Luchi CT24同步的BMDCs一起添加到相同的ZT7穗上时，观察到相同的结果（图1n和补充视频3），表明迁移到lv的节律性是由于dc内在机制。白天（PER2-Luclo CT36）的BMDCs在白天耳（ZT7）上的细胞浸润最大，而夜间（PER2-Luclo CT24）的BMDCs在夜间耳（ZT19）上的细胞浸润最小（图10）。白天（PER2-Luclo CT36）夜间（ZT19）耳的BMDCs以及夜间（per2 - lucchi CT24）白天（ZT7）耳的BMDCs迁移到lv的能力处于中等水平（图10），表明细胞和环境的同步分别提供了最大和最小的迁移能力。同步的PER2-Luclo CT36（最大日迁移能力时间）BMDCs比未同步的BMDCs迁移得更好（图1m， 0），表明节律对整体DC迁移行为有好处。此外，在胶原凝胶趋化实验中，PER2-Luclo CT36天BMDCs的迁移速度高于PER2-Luchi CT24夜间BMDCs（图1p）。这些观察结果表明，皮肤DC向传入淋巴的迁移受到微环境和DC自主机制的控制。

接下来，我们使用定量原位成像方法来评估DC向lv输送的信号是否在LECs中振荡（扩展数据图3a，b）。上皮屏障器官（如皮肤、肺和肠道）以及LNs中的传入LECs具有粘附分子的组织特异性时间表达谱（图2a，扩展数据图3c-g和补充表2）。在皮肤中，我们观察到LYVE-1、CD99、JAM-A和JAM-C的强振荡，这些分子与稳态DC迁移有关23。而其他粘附分子存在，但不振荡（如VE-cadherin和PECAM-1）或根本不表达（如VCAM-1和ICAM-1）；图2a、b和扩展数据图3g)。随着时间的推移，综合所有器官的所有信号的谱显示，振荡信号的表达在白天达到峰值（图2c），表明评估器官中的传入LECs此时具有更高的白细胞募集能力。与此相关的是，我们在人体皮肤活检中检测到LYVE-1和JAM-A的表达模式中存在类似的节律（图2d和扩展数据图3h）。与小鼠皮肤相比，人类真皮lv在12:00左右表达迁移信号的最低点（图2d和扩展数据图3h），这表明在小鼠和人类中，这些信号在这些生物体的活动性阶段呈现低谷。

图2：促迁移因子在LECs和DCs中的日表达。
figure 2

a， LYVE-1+耳lv表达分子的免疫荧光筛选。无/低表达

源数据

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实时荧光定量PCR （qPCR）分析小鼠真皮CD31+podoplanin+ LECs在ZT1、ZT7、ZT13和ZT19位点（扩展数据图4a），发现Lyve1和Cd99的mRNA量在夜间出现峰值（图2e和扩展数据图4b），表明这些节律受到转录控制。为了获得LECs内全球时间依赖性变化的无偏见解，我们对分选的真皮CD31+podoplanin+ LECs在ZT1， ZT7， ZT13和ZT19进行了大量RNA测序分析（扩展数据图4c）。LECs在生物钟的核心成分中表现出强烈的振荡，包括转录因子Bmal1和Per2（图2f和扩展数据图4d）。此外，氧化石墨烯富集分析产生了高度节律性的细胞特征，特别是在粘附过程中（GO:0022610）（图2g-i和补充表3）。在ZT7（白天）和ZT19（夜间）对耳部外植体培养基进行的流式细胞术显示，CD103-EpCAM -真皮cdc和CD103-EpCAM + lc在ZT7与ZT19相比表达升高（图2j和扩展数据图4e，f），而CCR7 mRNA在同步CT18、CT24、CT30和CT36 BMDCs表现出昼夜节律表达谱，在CT24达到峰值（图2k）。这些观察结果表明，LECs表达生物钟机制，LECs和DCs以节律方式表达促迁移因子。

由于趋化因子受体CCR7在dc中的表达具有节律性，因此我们研究了CCR7配体CCL21在LECs中的表达。在小鼠耳的定量免疫荧光成像分析中，CCL21蛋白在LECs的细胞内表达在ZT7处达到峰值（图3a，b）。CCL21在人体皮肤活检中也有节律性表达，在8:00达到峰值（图3b）。小鼠LECs中Ccl21 mRNA丰度在夜间达到峰值（ZT19）（图3c），表明与Ccl21蛋白相比，它发生了相移，并指向其节律表达的转录控制24。在小鼠皮肤内的高尔基体和LECs细胞内囊泡中，在ZT7（白天）检测到的CCL21蛋白表达高于ZT19（夜间）（扩展数据图5a，b），表明其在昼夜释放到环境中。我们使用非透性全耳支架的定量免疫荧光成像来分析小鼠细胞外间质组织中的CCL21梯度8。使用距离依赖的荧光掩膜（扩展数据图5c）表明，在ZT7（白天）比ZT19（夜晚）对CCL21的免疫反应性更高，特别是在lv附近（图3d）。通过添加外源性CCL21、肝素酶消化8或CCL21抗体来消除CCL21梯度，与对照处理的样品相比，降低了ZT7时DC向lv的迁移，并完全消除了ZT7（白天）和ZT19（夜间）之间DC迁移的差异（图3e和扩展数据图5d-g）。与对照小鼠产生的BMDCs相比，Ccr7 - / - BMDCs向lv的迁移明显减少，并且缺乏节律性（图3f）。在胶原凝胶趋化实验中，CT24和CT36的同步Ccr7 - / - BMDCs与同步野生型（WT）对照BMDCs相比，在迁移速度上没有差异（图3g），表明Ccr7的昼夜表达控制了DC迁移的节律性。

图3:DC昼夜迁移的时间药理学。
figure 3

a， CCL21在渗透性耳中的显像。图像是两个独立实验的代表。比例尺，70µm。b、小鼠LYVE-1+ lv中CCL21的定量免疫荧光筛选(左；N = 5只来自两个独立实验的小鼠)和人类(右；N = 5-11人)皮肤样本；星号表示单向方差分析的结果，数字符号表示余弦分析的结果。c， qPCR检测分选真皮LECs中归一化Ccl21表达。数据为两个独立实验的代表性数据；N = 3只；Tukey后验单因素方差分析。d， CCL21非渗透性耳廓定量成像；2个独立实验N = 5只；Mann-Whitney紫外线测试。比例尺，50µm。e，经过爬行检测和添加外源性（exo） CCL21（左）、肝素酶（hep）处理（中）或抗CCL21抗体阻断（右）后的耳CD11c+细胞；N = 3只小鼠，代表两个独立的实验。f，使用Ccr7 - / -或对照细胞进行爬入实验后的耳BMDCs；N = 3只小鼠，代表两个独立实验；双向方差分析与Sidak后检验的e和f。g，同步WT和Ccr7 - / - BMDCs在胶原迁移分析中的速度；N = 3只小鼠，代表两个独立实验；Kruskal-Wallis测试和Dunn的后测。h，经爬入实验和抗体处理后的耳CD11c+细胞；N = 3只小鼠，代表两个独立实验；采用Sidak后检验的双向方差分析。i，使用Cd99 - / -动物进行爬入实验后的耳部CD11c+细胞（对照，虚线）；2个独立实验N = 5只；非配对学生t检验。j,k，耳CD11c+细胞经过爬入实验和抗体处理；N = 6只小鼠（来自j的两个独立实验），N = 3只小鼠（来自k的两个独立实验的代表性）；采用Sidak后检验的双向方差分析。l，耳朵爬行实验后CD11c+细胞与lv距离的定量成像；学生的学习;N = 314、451、450、453、374、408、394、396、374和419个细胞（从左至右）比例尺，10µm。轮廓为正交LV视图。虚线表示拟合余弦曲线。所有数据均以mean±s.e.m表示。

源数据

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在耳部外植体实验中，抗体介导的LYVE-1、CD99和JAM-A阻断导致CD11c+ DC在ZT7（天）时向皮肤淋巴的迁移明显减少，而在ZT19（夜）时DC迁移没有观察到任何影响（图3h和扩展数据图6a-d）。JAM-C阻断可减少DC在ZT7或ZT19的日变化，但不减少DC向传入淋巴的迁移（扩展数据图6e），而Fc受体阻断对DC向LVs的运输没有影响（扩展数据图6f）。CD99 - / -小鼠证实了CD99在淋巴迁移中的相关性（图3i）。由于单个阻断方法消除了DC迁移的日差异，并且仅在ZT7（白天）而不是ZT19（夜间）阻断了DC向传入淋巴的迁移，因此我们测试了这些信号是否有冗余作用。联合阻断LYVE-1、CD99和JAM-A可减少DC在ZT7和ZT19处向lv的迁移，而另外阻断CCL21可完全抑制DC在两个时间点向传入淋巴的浸润（图3j、k和扩展数据图6g、h）。我们使用距离和分布分析来量化每个分子在有节奏的迁移过程中的哪一步是必需的。阻断LYVE-1、CD99或JAM-A可在附着于LEC的水平上阻止DCs。相比之下，阻断CCL21将dc保留在间隙区（图31和扩展数据图6i），表明dc的迁移受到促迁移因子的连续相互作用的严格控制。

最后，我们评估了内皮细胞和DC中生物钟基因在控制DC从皮肤迁移中的作用。Cdh5creERT2Bmal1flox小鼠的dc在血液内皮细胞和LECs中缺失了昼夜节律转录因子BMAL1 (BMAL1ΔEC)， Prox1creERT2Bmal1flox小鼠的dc在LECs中缺失了BMAL1 (BMAL1ΔLEC)（扩展数据图7a，b），与Bmal1flox对照小鼠相比，在ZT7和ZT19收集的耳朵中没有节律性迁移到皮肤LVs中（图4a，b和扩展数据图7c，d）。此外，cDCs中缺乏BMAL1的cle9acrebmal1flox小鼠（BMAL1ΔcDC）与Bmal1flox对照小鼠相比，在耳部皮肤外植体中，DC向LVs的迁移明显减少且无节律性（图4c）。此外，Per1 - / - per2 - / -或Bmal1 - / -小鼠产生的同步BMDCs在与耳朵孵育时没有节律性迁移行为，与同步WT BMDCs相比（图4d，e）。这些观察结果表明，lec和DC中的生物钟蛋白是DC节律性迁移到lv所必需的。

图4：谱系特异性BMAL1缺陷破坏DC淋巴运输的节律。
figure 4

a-c，耳部CD11c+细胞（绿色）或BMDCs（橙色），在与谱系特异性Bmal1 - / -动物进行爬行实验后；N = 4,4,3和3只小鼠（左）和5,5,4和5只小鼠（右）(a)；N = 4,4,4和5只小鼠（左）和4,4,3和3只小鼠（右）(b)；N = 4、4、5、5只小鼠(c)；数据为两个独立实验的代表性数据；采用Sidak后检验的双向方差分析。b,c，对照动物和BMAL1ΔLEC (b)或BMAL1ΔcDC (c)动物的代表性耳朵全挂载图像。比例尺，50µm。d，同步对照，Per1 - / - per2 - / -或Bmal1 - / - BMDCs，爬入实验后的耳BMDCs；WT细胞组n = 6只，敲除（KO）细胞组n = 3只，代表两个独立的实验；采用Sidak后检验的双向方差分析。e，同步WT和Per1 - / - per2 - / - BMDCs在胶原凝胶迁移实验中的速度；N = 3只。数据为两个独立实验的代表性数据；Kruskal-Wallis测试和Dunn的后测。f,g， LYVE-1+耳lv中LYVE-1 (f)、JAM-A、CD99和CCL21 (g)的免疫荧光定量筛查；2个独立实验N = 5只；采用Sidak后检验的双向方差分析。h,i， WT和BMAL1ΔLEC耳CCL21全挂耳成像(h)和定量(i)；2个独立实验N = 5只；Kruskal-Wallis测试和Dunn的后测。虚线表示LYVE-1+毛细血管。比例尺，50µm。j、流式细胞术分析CCR7对对照和BMAL1ΔcDC动物CD11c+MHCII+ CD103-EpCAM - dc的影响；2个独立实验分别取7、5、6、4只小鼠；采用Sidak后检验的双向方差分析。k，耳朵爬行实验后CD11c+细胞与lv距离的代表性图像和定量；N = 340、431和575个细胞来自4只小鼠，分别来自两个独立的实验；非配对学生t检验。比例尺，10µm。轮廓为正交LV视图。l，与IgG对照相比，BMAL1结合Ccl21、Ccr7和Lyve1启动子区域的染色质免疫沉淀（ChIP）；N = 6只独立实验小鼠；采用Sidak后检验的双向方差分析。所有数据均以mean±s.e.m表示。

源数据

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接下来，我们用定量免疫荧光分析了促迁移因子在皮肤LECs中的表达。BMAL1ΔEC和BMAL1ΔLEC小鼠在CCL21、LYVE-1、CD99、JAM-A和JAM-C中表现出非节律性的LEC表达，而非节律性表达的分子CD31的表达不受影响（图4f、g和扩展数据图8a、b）。此外，在这些小鼠中，CCL21表达梯度的时间差异也消失了（图4h，i）。BMAL1ΔcDC小鼠的cdc未表现出CCR7的节律性表达，而与Bmal1flox对照小鼠的lccs相比，BMAL1ΔcDC lccs中的CCR7表达正常（图4j和扩展数据图8c）。距离和分布成像分析表明，与BMAL1ΔcDC小鼠相比，BMAL1ΔLEC小鼠的DC在距离间质区LECs更远的地方停留（图4k和扩展数据图8d），这表明内皮细胞BMAL1表达缺乏导致DC向LVs迁移的损失比DC BMAL1的损失更明显。这些数据以及BMAL1在Ccl21、Ccr7和Lyve1基因启动子区域的典型e -box结合位点的存在（扩展数据图8e）表明，这些基因直接受到生物钟的调节。ChIP检测到BMAL1与这些启动子的节律性结合，在ZT13处达到峰值（图41和扩展数据图8f），表明BMAL1直接控制DC向传入lv迁移的信号。

总之，我们在这里提出的证据表明，dc向皮肤淋巴管的迁移是一个有节奏的过程。我们发现CCL21、CCR7和LYVE-1受生物钟基因BMAL1的直接控制，这意味着生物钟是DC迁移的重要和广泛的调节器。由于这一过程是产生适应性免疫的基础，考虑到先天免疫和适应性免疫反应的节律性在炎症反应中得到维持，它应该被证明在疫苗接种和免疫治疗方案中是有用的13,14,21,25,26,27。我们还观察到人类促迁移因子表达的类似但相移的节律性，这表明在小鼠中观察到的这些功能性昼夜差异也适用于人类。

方法

小鼠模型

6-8周龄雄性WT C57BL/6N小鼠购自Charles River实验室或Janvier实验室。Cdh5-creERT2 （B6）小鼠是R. Adams （Max Planck分子生物医学研究所）赠送的，并与Jackson实验室获得的Bmal1flox/flox （B6）小鼠杂交，以靶向血液内皮细胞和LECs。将Prox1-creERT2 （B6）小鼠（Jackson Laboratories）与Cdh5-creERT2-Bmal1flox/flox小鼠杂交，获得特异性靶向LECs的Prox1-creERT2- bmal1flox /flox小鼠。在小鼠6周龄时，连续5天腹腔注射他莫昔芬，诱导Cre重组酶的表达，并在各自的flox区域切除Bmal1。将EYFP； cle9acre小鼠与Bmal1flox/flox小鼠杂交以靶向cDCs28。使用6-8周龄Cd99 - / -小鼠和Ccr7 - / -小鼠、Bmal1 - / -小鼠和Per2::Luc小鼠的骨髓（BM）细胞。来自Per1 - / - per2 - / -小鼠的原代骨髓细胞由J. Ripperger和U. Albrecht （University of Fribourg）提供。

所有动物都在生物医学中心（Ludwig-Maximilians-Universität）或日内瓦大学的核心设施动物模型中按12小时亮/12小时暗的时间表饲养，并可随意获得水和食物。为了方便在一天的不同时间点同时进行实验，使用光柜（Techniplast）将动物转移到不同的光-暗周期。在需要改变光照模式的实验中，小鼠被置于完全黑暗的环境中，或被给予2周的时间来适应相反的光照模式。所有的动物程序和实验都符合上巴伐利亚州动物福利部和德国动物福利法的规定，或者按照日内瓦动物研究委员会的指导方针批准和执行。

人体皮肤活检取样

在局部麻醉下，在日内瓦大学医院皮肤外科切除皮肤肿瘤，对男性和女性成人（平均年龄74岁）进行皮肤活组织检查。获得每位受试者的书面知情同意。抽样是根据《赫尔辛基宣言》进行的，并得到日内瓦大学医院研究伦理委员会的批准。在皮肤外科手术切除重建期间，从被称为“布洛三角形”的过度无肿瘤周围皮肤中提取样本。没有额外的切口来获取样本，并且本研究没有改变原始肿瘤切除的大小。切除后立即将样本放入生理盐水中，并记录一天中的时间。然后将样品包埋在最佳切削温度化合物（OCT）中并震荡冷冻直到切片。

BMDC细胞培养、同步和标记

采用R10培养基（RPMI， 10%胎牛血清（Gibco）， 2 mM l-谷氨酰胺，1%青霉素/链霉素和50µM β-巯基乙醇），添加20 ng ml-1粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）杂杂瘤上清液培养外源性爬行试验用bmdc。使用转基因- csf产生的杂交瘤细胞29。采用mGM-CSF定量因子ELISA试剂盒（R&D Systems）测定上清液中GM-CSF浓度。

细胞培养10 d。第10天，收集所有非贴壁细胞，将其浸泡在含有10 ng ml-1 GM-CSF的R10培养基中，并用100 ng ml-1 LPS （Sigma-Aldrich）刺激24 h。通过分析dapi阴性BMDCs中MHCII和CD11c的表达来检测BMDCs的活力和纯度。

为了同步BMDCs，在第8天，每个样本培养复制7 × 106个BMDCs。第二天，将BMDCs置于50%马血清（Merck, H1138）中2小时（休克）20,22，随后进行两次洗涤，第10天接受LPS刺激。

成熟和刺激后，将所需数量的细胞与5µM的CellTrace Violet或CellTrace Yellow (1:1000；Thermo Fisher)，彻底清洗并调整至最终浓度为5-7.5 × 105个细胞/ ml，用于迁移试验。

Luciferase-expressing BMDCs

在BMDC同步实验中，从Per2::Luc小鼠中采集BM并按上述方法生长。第8天，收集所有非贴壁细胞，以2 × 105个/ ml的浓度在完全培养液中重悬。将细胞复制到35毫米培养皿中（每皿2毫升），过夜恢复。为了同步，细胞在含50%马血清的完整培养基中孵育2小时。同步后，用完全培养液轻轻洗涤细胞以去除多余的血清，并将细胞留在含有100µM荧光素（bivolume）和LPS的2ml新鲜培养基中。用副膜密封培养皿，转移到LumiCycle （Actimetrics）进行生物发光记录。每分钟的光子计数采用24小时移动平均值来计算相对生物发光。

外源性BMDC爬行迁移试验

对于外源性BMDC爬行迁移实验，小鼠按照动物实验方案被杀死。仔细收集耳廓，分离耳背和耳腹，并用培养基快速冲洗。将耳朵放置在定制的成像室中并固定。标记的BMDCs（25,000-37,500）添加到耳朵上10-15分钟。洗掉任何未结合的BMDCs后，用R10培养基完全覆盖耳朵，孵育最多3小时。用LYVE-1、CD31或podoplanin的不同组合对整个耳座进行染色，然后用4%多聚甲醛固定。使用蔡司Axio检测器获得整耳图像。Z1型共聚焦旋转圆盘显微镜配备了405、488、561和640 nm激光源。

终点分析中，每只耳朵至少从lv（预采集和毛细血管）采集8张图像。使用斐济和Slidebook 6.0中的三维（3D）可视化工具以及正交视图和光学切片对血管内外的细胞数量进行计数。然后将该数字归一化为计算出的血管体积。

对于短期爬行，间隙区域的距离依赖区域分割和积累分析被使用。加入BMDC洗净后，在培养基中培养0-60分钟，按上述方法染色和成像。在每个z投影中，手动勾画CD31+ LV轮廓，生成二值掩码，并使用Matlab定制脚本在间隙区域中应用LV距离相关地图创建特定的片段。在这些段内手工统计bmdc，并计算相对分布。

内源性皮肤DC动员和爬入试验

对于内源性白细胞爬行迁移试验，根据动物实验方案杀死小鼠，并将收集的耳朵分开。初次清洗后，将耳半放在真皮层朝下的培养基中保存6小时或24小时。之后，耳片用4%多聚甲醛固定，并染色CD11c、LYVE-1和/或CD31。对细胞进行计数和归一化，并如上所述生成逆出比。

BMDC爬入检测的实时成像

对于外源性爬入试验的实时成像，如上所述制备整个耳架；然而，在用于贩运试验之前，它们要进行初步染色。用一抗对耳朵进行层粘连蛋白染色，然后在室温下用fitc结合的二抗在培养基中进行探针，然后接受50,000-75,000 BMDCs 10分钟。洗去未结合的BMDCs，将耳半浸入添加10 mM HEPES （Sigma）的无酚红R10培养基中。在37°C的5% CO2室中进行成像，每100秒采集一张30-40 μ m深的3D图像，持续45-60分钟。使用斐济的TrackMate和手动跟踪插件以及伊比迪趋化性和迁移工具计算迁移路径、距离图和速度、方向性、欧几里得和累积距离。

蛋白质的功能阻断和趋化因子梯度的消除

为了研究参与节律性皮肤DC运输的蛋白质的功能相关性，使用了抗体或酶。在进行迁移实验前，外源性爬行细胞的耳朵在含有稀释的中和抗体的培养基中孵育1小时，或直接添加到内源性爬行细胞培养基中孵育24小时（见补充信息中的抗体列表）。

为了消除细胞外CCL21梯度，用肝素酶II和IV (100 mIU；Sigma)在37°C下放置1小时，或在4°C下放置在含有0.1%牛血清白蛋白和0.6µg ml-1 CCL21 （Peprotech）的PBS中放置90分钟，然后迁移。随后洗去未结合的CCL21或剩余的肝素酶。

淋巴距离分析

为了测量dc和LV之间的距离，使用正交视图，最大z投影和3D观看器的组合。每个生物重复至少取250个CD11c+细胞进行分析。为了计算lv的平均直径，我们用40只血管作为代理。然后使用Fiji手动测量LV和DC中心之间的距离。

”分析

将收集和分离的穗洗净2 h，在R10培养基中添加1µg ml-1 CCL21保存24 h。第二天，收集耳朵，在37℃下用胶原酶IV (1 mg ml-1；C5138, Sigma), DNase (0.2 mg ml-1；罗氏)和ⅱ型糖尿病(0.2 mg ml-1；σ)。消化后，细胞通过70µm细胞滤器过滤，洗涤并在添加2%胎牛血清和2mm EDTA （Sigma）的PBS中重悬。同时，收集含有迁移DC的培养基，首先在室温下用抗小鼠CD16/CD32阻断Fc受体5分钟，然后在4℃下用荧光偶联抗体染色30分钟。对于CCR7，在其他染色步骤之前，在37°C下单独进行染色。将DAPI和全亮计数珠（Thermo Fisher）加入细胞中，然后使用配备405、488和633 nm激光器的Gallios流式细胞仪（Beckman Coulter）或BD Fortessa流式细胞仪（405、488、561和633 nm激光器）进行流式细胞术分析；BD生物科学)。

体外DC迁移试验

同步的BMDCs（500,000）被洗涤并用于体外趋化迁移试验30,31。制备胶原凝胶混合物，将30µl的10倍MEM和15µl的7.5%碳酸氢钠混合至溶液变为粉红色。然后，加入225µl Nutragen（纯化的牛胶原I溶液6 mg ml-1），混合均匀。仔细混合200微升胶原凝胶混合物和100微升细胞悬浮液，以避免气泡的形成。280微升的混合物被移液到定制的腔中。在37°C和5% CO2下聚合75分钟后，用80µl CCL21（1µg ml-1）覆盖凝胶。然后，用石蜡密封这些腔室。

对于细胞迁移的成像，使用倒置宽视场徕卡DMi8显微镜，使用×4物镜，徕卡Lumencor spectrx多led光源，37°C孵育室和加热台，每60 s记录一张图片，持续5小时。

对于细胞迁移分析，由于技术原因导致的初始图像不稳定，将记录的前30帧排除在外。使用定制的脚本在ImageJ中分析第31到300帧32。

局部FITC耳刺激

FITC (8mg ml-1；使用前将邻苯二甲酸二丁酯（Sigma）与丙酮（Sigma）以1:1的比例搅拌均匀。用异氟醚吸入麻醉小鼠，取25µl异氟醚溶液涂抹于耳部皮肤，静置24 h，取耳部进行影像学分析。

免疫荧光染色

为了测量粘附分子在LECs中的表达水平，在四个时间点收集小鼠器官（皮肤、腹股沟LN、肺和小肠），置于OCT （TissueTec）中，在干冰上震荡冷冻，保存在- 80°C。第二天，将器官解冻至- 20°C，在低温恒温器（Leica）26上切片，厚度为10µm。组织切片保存在- 80°C或直接解冻至室温，并用疏水耐酒精笔圈起来。切片用冷甲醇(100%；Sigma) 10分钟，在含有Triton X-100 (0.5%；Sigma)和正常山羊血清(20%；σ)。在4°C下对切片进行LYVE-1与感兴趣的蛋白质（见补充信息中的抗体列表）联合染色过夜。第二天，用PBS洗涤样品并成像。

为了在组织玻片上染色CCL21，用亲和素（20%）扩大阻断层。将载玻片彻底清洗，并在含有20%生物素的PBS （Vector Labs）中孵育，在4°C下对切片进行LYVE-1和ccl21 -生物素染色过夜。第二天，用PBS洗涤样品，并在室温下用标记的链亲和素（每片2.5µg）孵育15分钟。

为了定量，取同一只小鼠同一切片不同区域的5张图像，取平均值，计算为1个生物重复。从感兴趣的蛋白染色的MFI中扣除5个同型染色的平均MFI。然后将MFI归一化为所有zt的第二高值。生成了zt之间MFI的折射率变化值，并以热图的形式显示。

全载免疫荧光染色

为了更好地了解在LECs上或LECs中表达的蛋白质的3D结构，我们对耳朵进行了完整的安装和3D成像。抗体染色前后进行耳固定。在CD31或PROX-1染色的情况下，染色后固定。如果染色LYVE-1、podoplanin、层粘连蛋白、CCL21、GOLPH4、VE-cadherin或CD11c，染色前固定耳。

GOLPH4和CCL21染色，第二天洗耳，室温下用二抗染色2小时。对整个坐骑进行如上所述的成像。

CCL21梯度分析

为了可视化和分析细胞外CCL21梯度，如前所述，将收集的和固定的耳朵仔细清洗，并在含有亲和素（20%）的R10培养基中封闭1小时8。将耳朵置于PBS和生物素（20%）中30分钟后，在4°C下进行LYVE-1和CCL21（生物素）染色过夜。次日，用pe标记的链亲和素在暗处4℃下孵育3小时并成像。

间质CCL21趋化因子信号的强度在最大强度投射范围为30- 40 μ m的z堆栈上量化，z步长为1 μ m。使用自定义编写的Matlab脚本，由实验人员在各自的实验条件下手动勾画LV毛细血管，并将其转换为二进制掩模。然后对每个二值掩模进行欧氏距离变换，得到每个非掩模像素到其最近的掩模边界/LV的最短欧氏距离。欧几里得距离被四舍五入，并通过显微镜的嵌入像素分辨率转换成公制单位。然后将距离掩模应用于各自的CCL21染色，提取荧光强度并在距离上取平均值，从而得到每个图像的距离相关荧光强度度量。将CCL21染色的平均强度图像整合到距离依赖的荧光强度中。将同一只小鼠耳朵内不同位置的五个平均距离依赖荧光强度平均为一个生物重复。ZT7和ZT19的所有样品归一化为ZT7的最高平均荧光强度。同型染色作为阴性对照。

CCL21定位分析

为了在细胞内定位CCL21，如上所述，将耳固定、渗透和阻断。在CCL21， LYVE-1和GOLPH4染色后，使用一抗和适当的二抗，每只耳朵至少有五个不同的区域被成像。使用Fiji对步长为1微米的30至40微米的z堆进行z投影和分析。在golph4高区和golph4低区LYVE-1+细胞中量化CCL21信号强度。然后从CCL21染色中扣除同型对照的MFI。

LECs的分类

为了对真皮LECs进行RNA测序，在每个生物重复和时间点收集了两只小鼠的四只耳朵。按照上述方法分离真皮细胞，并在慕尼黑生物医学中心的Core Facility Flow Cytometry的FACSAria IIIu （BD）上进行分选，该设备配备了四种激光器（405、488、561和633 nm）。活podoplanin+CD31+ LECs直接分选到350µl TriZol-LS （RNA测序时为Thermo Fisher）或350µl含有β-巯基乙醇（1:100）（qPCR时分别为Qiagen和Sigma）的RLT缓冲液中，在4°C下使用100µm喷嘴，每次分选后纯度检查确定纯度为> - 90%。每两对耳池的细胞数在3000到5000个之间。分选后，样品直接在干冰上震荡冷冻并储存以供进一步分析。

RNA序列

在TriZol-LS中收集的分选真皮LECs的RNA按照制造商的说明使用Direct-zol RNA迷你准备试剂盒（ZymoResearch）纯化。分离的RNA使用Nanodrop （Thermo Fisher）进行定量，并在生物分析仪（Agilent）上使用RNA 6000 Nano或Pico试剂盒（Agilent）进行分析。洗脱的总RNA （75 ng）用DNase （Thermo Fisher）酶切去除DNA污染。用RNAClean XP微珠（agcourt）进行额外的纯化步骤。纯化的头结合RNA直接作为SMART-Seq v4超低输入RNA试剂盒（TaKaRA Bio）的输入。按照制造商的说明生成全长cDNA。使用量子比特dsDNA HS Assay kit （Invitrogen）和量子比特荧光仪对全长cDNA进行定量。最后，按照NexteraXT协议（Illumina）使用500 pg全长cDNA生成测序文库。文库在生物分析仪（Agilent）上使用DNA 1000试剂盒（Agilent）进行定量，在HiSeq1500系统（Illumina）上进行测序，单端模式下读取长度为100个核苷酸。

对于数据处理，获得的转录组谱在由LAFUGA（基因中心）托管的Galaxy web界面上进行处理。在解复用和修剪后，使用RNA-STAR映射器（Galaxy version 2.5.2b-0）将数据映射到小鼠基因组（mm10）上。使用HTSeq-count （Galaxy version 1.0.0）对大量读取进行计数。随后使用DESeq2 （Galaxy version 2.11.40.6）软件进行基因表达分析，检测差异表达基因，错误发现率<0.05。测序数据已存入NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)，可通过GEO系列登录号GSE184758访问。

氧化石墨烯簇富集分析

GO簇富集是使用metascape.org生成的（参考文献33）。将DESeq2分析中P≤0.05的富集基因组织到基因列表中，筛选氧化石墨烯生物工艺富集。以P值≤0.01、最小计数为3、富集因子≥1.5为截止参数。根据遗传术语的隶属度相似度进行聚类。

为了比较生物粘附（GO:0022610）基因计数，对测序结果进行筛选，筛选出GO:0022610簇基因，并将显著上调和下调的基因编译成热图。

qPCR

rlt分选的LECs或裂解的同步bmdc解冻并充分混合。按照制造商的说明使用RNeasy micro kit （Qiagen）分离RNA。使用NanoDrop2000 （Thermo Scientific）分析RNA样品以确定RNA的浓度和质量。用高容量cDNA反转录试剂盒（Applied Biosystems）将获得的RNA直接反转录为cDNA。cDNA样品在使用前保存于- 20°C。采用StepOnePlus实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems）在96孔板上使用SYBR绿色兼容引物进行qPCR。每个qPCR样品一式重复分析。反应总体积为10µl，其中SYBR绿剂5µl，引物混合物（5µM） 1µl，水3µl， cDNA 1µl。基因表达水平归一化到管家基因Rpl32。

芯片分析

动物被杀死后，将排水液快速冷冻在干冰上，在- 80°C保存后再加工。组织在1ml匀浆缓冲液（10mm HEPES-KOH, 10mm KCl, 5mm MgCl2, 0.5 mM DTT和1x完全蛋白酶抑制剂（罗氏））中均浆。将匀浆固定在含有1%终甲醛（Thermo Fisher Scientific）的PBS中。分离细胞核，通过超声（Diagenode Bioruptor）获得染色质悬浮液，获得0.2-0.8千碱基大小的片段。用抗bmal1 （D2L7G, Cell Signaling Technology）或对照IgG （Abcam）进行免疫沉淀。采用MinElute PCR纯化试剂盒（Qiagen）分离DNA。使用Qubit dsDNA HS试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测定DNA浓度。使用SYBR Green Master Mix （Roche）在LightCycler 480 II （Roche）上进行实时ChIP-qPCR。BMAL1在Ccr7、Ccl21、Lyve1和Per2启动子上的占用率通过qPCR确定了含有e -box的区域，使用SCOPE motif finder和EPFL真核数据库进行了定量分析。相对富集以输入的百分比来确定。

统计数据

所有图均表示来自独立生物复制的合并数据，例外情况在图图例中说明。对每个生物重复分别进行了充分的对照实验。重复的验证是独立进行的，只有当所有的重复都显示出不变的结果时，它们才被合并。使用GraphPad Prism进行完整的统计分析，包括余弦检验，考虑正态和非正态数据分布；*或#，P < 0.05；**或##，P < 0.01；***或###，P < 0.001；****或####，P < 0.0001。

报告总结

关于研究设计的更多信息可以在本文链接的《自然》研究报告摘要中找到。