摘要
乳腺癌是复杂的细胞生态系统，其中异型相互作用在疾病进展和对治疗的反应中起着核心作用。然而，我们对它们的细胞组成和组织的了解是有限的。在这里，我们提出了一个单细胞和空间分辨转录组学分析人类乳腺癌。我们开发了一种单细胞内禀亚型分类(SCSubtype)方法来揭示复发性肿瘤细胞的异质性。通过测序对转录组和表位进行细胞索引(CITE-seq)的免疫分型提供了高分辨率的免疫图谱，包括与临床结果相关的新的PD-L1/PD-L2+巨噬细胞群。间充质细胞在三个主要谱系中通过分化表现出不同的功能和细胞表面蛋白表达。基质免疫壁龛在肿瘤中有空间组织，为抗肿瘤免疫调节提供了见解。使用单细胞特征，我们对大型乳腺癌队列进行解卷积，将其分为9个集群，称为“生态型”，具有独特的细胞组成和临床结果。这项研究提供了乳腺癌细胞结构的全面转录图谱。
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数据可用性
所有处理过的scRNA-seq数据都可以通过Broad研究所单细胞门户网站https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell/study/SCP1039进行浏览器内浏览和下载。本研究处理后的scRNA-seq数据也可通过Gene Expression Omnibus获取，登录号为GSE176078。本研究的原始scRNA-seq数据已存放在欧洲基因组-表型档案中，该档案由欧洲生物信息学研究所和基因组调控中心托管，登记号为:EGAS00001005173。本研究的所有空间解析转录组学数据可从Zenodo数据存储库(https://doi.org/10.5281/zenodo.4739739)获得。Andersson等人56的空间解析转录组学数据可以从Zenodo数据存储库(https://doi.org/10.5281/zenodo.3957257)下载。
代码的可用性
与本研究中分析相关的代码可以在GitHub上找到https://github.com/Swarbricklab-code/BrCa_cell_atlas(参考文献72)。
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致谢
这项工作得到了澳大利亚国家乳腺癌基金会(NBCF)的研究资助(no. 5)。irs -19-106)，并得到J. McMurtrie, AM和D. McMurtrie, Petre基金会，白蝴蝶基金会，悉尼乳腺癌基金会，Skipper Jacobs慈善信托基金，G. P. Harris基金会和国家卫生与医学研究委员会(NHMRC)的慷慨支持。A.S.是NHMRC高级研究奖学金的获得者。APP1161216)。S.Z.W G.A.-E。和J.T.获得了澳大利亚政府研究培训计划奖学金的支持。S.O.T.由NBCF (PRAC 16-006;不。IIRS-19-084)，悉尼乳腺癌基金会和M. O 'Sullivan的家人和朋友。sj获得了NBCF的研究奖学金。X.S.L.是由乳腺癌研究基金会(no。BCRF-19-100)和美国国立卫生研究院(no。R01CA234018)。cmp和A.T.是由美国国家癌症研究所乳腺孢子项目(no。P50-CA58223)，批准号:RO1-CA148761，乳腺癌研究基金会。这项工作得到了澳大利亚转化性乳腺癌研究中心Walter和Eliza Hall研究所的支持，并得到了NHMRC卓越研究中心的资助。APP1153049。E.L.作为国家乳腺癌基金会的捐赠主席和爱你的姐妹基金会得到了支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定发表或准备手稿方面没有任何作用。我们感谢以下人员对本文实验部分的协助:J. Yang;Garvan医学研究所组织培养设施的G. Lehrbach;来自Garvan组织病理学设施的A. Zaratzian，负责组织处理和免疫组化染色，并指导Visium实验;Garvan-Weizmann细胞基因组学中心，包括E. Lam, H. Saeed和M. Armstrong在流动分选方面的专业知识。我们感谢H. Holliday在图8g中提供的令人难以置信的插图。我们感谢h.h. Milioli为METABRIC队列数据集的分析提供指导。我们感谢作为消费者权益倡导者的夏皮罗和格兰特。这份手稿由生命科学编辑编辑。
作者信息
作者及单位
贡献
A.S.构思了这个项目，并指导了所有作者的研究。e.l.， s.w.， m.n.h.， b.c.， c.c.， c.m.， d.s.， e.r.， a.p.， j.b.， S.O.T, E.M.和L.G.参与实验设计，获取患者肿瘤组织并协助解释数据。S.Z.W G.A.-E。k。h。进行单细胞捕捉。K.H.分析了所有的临床信息。S.Z.W, K.H.和g.a.e。优化并进行肿瘤解离实验。G.A.-E。优化并进行CITE-seq实验的抗体染色。N.B.和g.a.e。进行了CITE-seq数据处理。c.l c和s.z.w在Chromium Controller上进行了scRNA-seq实验。c.l.c.帮助进行了下一代scRNA-seq文库的测序。s.z.w对scRNA-seq数据进行预处理、数据整合和重新聚类。J.T.对intercnv进行了分析和基准测试。A.T.和C.M.P.主导了SCSubtype的发展。dr解释并领导了乳腺癌基因分析的分析。K.H.和T.W.进行了H&E和IHC实验。在本研究中，S.O.T.对所有组织学进行独立评估和评分。G.A.-E。对来自s.j.c.a d和F.G.的智力输入的免疫细胞进行解释和分析，提供与髓系簇注释相关的智力输入。s。z。w解释并分析了所有基质细胞。D.K.和c.l.c.在J.E.P.的输入下进行了Visium实验，V.G.帮助进行了Visium数据集的预处理。s.r.w.， n.i.w.， c.r.u.， J.G.C.和Z.W.B.在一个独立的实验室进行了Visium实验和数据处理。A.A.在J.L. s.zw的指导下进行了立体镜反褶积，A.A.、l.l.、g.a.a. - e对Visium数据进行了下游分析。j.l.d.r.解释并执行了CIBERSORTx分析。s.z.w和dr进行生存分析。C.W.和X.S.L.提供了大量反褶积和生存分析的知识输入和指导。S.z.w, a.s.， dr, g.a.e。s。j。根据所有作者的意见撰写了手稿。
相应的作者
道德声明
相互竞争的利益
cmp是BioClassifier的股东和顾问;他也是乳腺PAM50亚型检测专利申请的发明人。J.L.是空间转录组学公司(Spatial Transcriptomics AB)拥有的专利的作者，该专利涵盖了本文中提出的技术。其他作者声明没有利益冲突。
额外的信息
Nature Genetics感谢Itai Yanai和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。同行评审报告是可用的。
施普林格·自然对已出版地图的管辖权要求和机构关系保持中立。
扩展数据
图1恶性细胞的鉴定、单细胞RNA测序指标以及基质细胞和免疫细胞的非整合数据。
a-b，本研究中通过scRNA-Seq分析的每个肿瘤的唯一分子标识符(a)和基因(b)的数量。肿瘤按临床亚型TNBC(红色)、HER2(粉色)和ER(蓝色)分层。菱形点代表平均值。c-d，本研究中鉴定的每个主要谱系细胞类型的唯一分子标识符(UMIs;c)和基因(d)的数量。这些主要的谱系层分为t细胞、b细胞、浆质母细胞、髓细胞、上皮细胞、循环细胞、间充质细胞(癌症相关的成纤维细胞和血管周围样细胞)和内皮细胞。菱形点代表平均值。e-f，所有71,220个基质细胞和免疫细胞的UMAP可视化，未进行批量校正和数据整合。UMAP降维使用了Seurat v3包中的100个主成分。细胞按肿瘤(e)和主要谱系层(f)分组，使用加内特细胞分类方法进行鉴定。g，按临床亚型分组的所有恶性细胞的intercnv热图。Tirosh等人报道的常见亚型特异性CNVs和chr6伪产物被标记(Tirosh等人，2016b)。
图2 SCSubtype分类器的补充数据。
a-b, TCGA患者mRNA-Seq数据的患者样本的allcell - pseudobulk(用黄色星星表示)和Ribozero mRNA-Seq(用蓝色星星表示)图谱。a，本研究中显示2个代表性肿瘤(CID4495和CID4515)的Allcells-Pseudobulk和Ribozero mRNA-Seq图谱配对的基础簇视图。b，本研究中显示4个代表性肿瘤(CID4067, CID4463, CID4290和CID3948)的Allcells-Pseudobulk和Ribozero mRNA-Seq图谱配对的luminal cluster视图。c，每个个体组中训练样本和测试样本的sc亚型基因集热图。彩色轮廓框突出了每组表达最多的基因。d, Barplot表示SCSubtype呼叫在单个样本中的比例。测试数据集样本在金色轮廓内突出显示。e，根据增殖评分(x轴)和分化- DScore (y轴)绘制的单个癌细胞的散点图。单个单元格根据SCSubtype调用上色。f，根据增殖评分(x轴)和分化- DScore (y轴)绘制的个体TCGA乳腺肿瘤散点图。个体患者根据PAM50亚型呼叫被着色。
图3乳腺癌基因模块的补充数据。
a，基于球形k-均值(skmeans)的574个肿瘤细胞ITTH特征的Jaccard相似性共识聚类。这显示了ITTH的每个签名被分配到七个簇/类之一的概率(p1-p7)。每个签名的剪影分数都显示出来。b，在所有单个肿瘤细胞中，对于七个ith基因模块中的每个模块(持有)和一组与乳腺癌相关的基因签名，缩放后的AUCell签名评分的成对Pearson相关性热图。使用Pearson相关性和平均连锁c进行分层聚类，热图显示所有单个肿瘤细胞(列)中七个ith基因模块(行)中的每个模块的缩放AUCell签名分数。分层聚类使用Pearson相关和平均联动。(HER2_AMP =临床HER2扩增状态)。d，每个基因模块特征(来自21个肿瘤的24,489个细胞)的特征评分分布(z-score缩放)。根据基因模块(GM1-7)细胞状态对细胞进行分组。e, Barchart显示了分配给每个基因模块细胞状态(GM1-7)的细胞比例，细胞根据sc亚型分组。f，每个基因模块特征的sc亚型评分分布(来自21个肿瘤的24,489个细胞)。根据基因模块(GM1-7)细胞状态对细胞进行分组。采用Kruskal-Wallis检验计算每个基因模块组中四个sc亚型评分组之间的显著性，p值显示。使用Wilcox检验确定分配给每个基因模块的细胞中哪个SCSubtype显著增加了SCSubtype评分，将每个SCSubtype的评分与其余SCSubtype评分进行比较(****:Holm调整p值< 0.0001,ns: Holm调整p值> 0.05)。d和f中的箱形图分别将第一和第三四分位数描述为下界和上界。须表示四分位数范围的1.5倍，中心表示中位数。
图4 CITE-seq小插图。
a，带有157个DNA条形码抗体的TNBC样本的UMAP可视化(补充表11)。聚类注释是从我们最终的乳腺癌图谱细胞注释中提取的。b, 157个CITE-seq抗体面板的聚类平均抗体衍生标签(ADT)值的热图可视化。只有免疫细胞被显示出来。c-d，使用seurat v3方法确定的测量实验ADT值(见上行)与CITE-seq输入ADT水平(见下行)的表达特征图。免疫分型t细胞的选定标记物(c;CD4、CD8A、PD-1和CD103)和骨髓细胞(d;显示PD-L1、CD86、CD49f和CD14)。
图5 t细胞和先天淋巴样细胞的补充数据。
a，点阵图显示典型标记在t细胞和先天淋巴细胞簇中的平均表达。b, t细胞和先天淋巴细胞簇的细胞毒性和功能失调基因标记评分。采用Kruskal-Wallis检验比较两组间的显著性(每组与平均值的两两双侧t检验，p值用星号表示:*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001)。红线表示中值表达式。c，不同临床亚型CD8: LAG3和CD8+ T: IFNG簇的功能失调基因标记评分(n = 26;TNBC 11例，ER+ 10例，HER2+ 5例)。对每个聚类进行两两双侧t检验以确定显著性。假定值用星号:* p < 0.05, * * * * * p < 0.01, p < 0.001, * * * * p < 0.0001。d，通过t细胞和髓细胞簇分层的差异表达的免疫调节基因在乳腺癌亚型中的比较。两两进行MAST比较以获得bonferroni校正的p值。所有基因均有统计学意义(p值< 0.05)。e、LAG3、CD27、PD-1 (PDCD1)和CD70在LAG3/c8 t细胞中对数正常化表达值在不同乳腺癌亚型中的两两双侧t检验比较(n = 26;TNBC 11例，ER+ 10例，HER2+ 5例)。f, METABRIC队列中临床亚型之间PDCD1、CD27、LAG3和CD70表达的富集(n = 1,608;209 Basal, 224 Her2, 700 LumA, 475 LumB)。两两Wilcox检验以确定统计学显著性。P量的值用星号:* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001。b和f中的箱形图分别将第一和第三四分位数描述为下界和上界。须表示四分位数范围的1.5倍，中心表示中位数。
图6免疫细胞表面受体在恶性、免疫和间充质细胞簇以及乳腺癌临床亚型中的基因表达。
a，按临床乳腺癌亚型(TNBC、HER2+和ER+)分组的所有细胞类型(TNBC、HER2+和ER+)中133个临床可靶向受体或配体免疫调节标志物的平均表达和聚类。通过系统地检索细胞表面表达的已知免疫调节蛋白，人工整理基因列表。通过' pheatmap '包使用分层聚类的默认参数来可视化基因表达值。
图7 b细胞、浆母细胞和髓系细胞的补充数据。
a，使用典型基因表达标记对所有重新聚集的b细胞(n = 3,202个细胞)和质母细胞(n = 3,525个细胞)进行UMAP可视化。b, CD27, IGHD, IGKC和IGLC2在naïve b细胞，记忆b细胞和浆母细胞中的特征图。c，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)特征评分，来自Cassetta等人，2019，以及所有髓系簇(来自26个肿瘤的9,675个细胞)中CCL8的日志正常化水平表达。采用两两双侧t检验来确定相关聚类的统计学显著性。假定值用星号:* p < 0.05, * * * * * p < 0.01, p < 0.001, * * * * p < 0.0001。红色虚线表示TAM模块评分或基因表达的中位数。采用Kruskal-Wallis检验比较各组间的显著性。d, LAM和DC:分别从Jaitin et al. 2019和Zhang et al. 2019获得的LAMP3基因表达特征，在髓系UMAP簇上可视化。e，通过骨髓团簇可视化氧化石墨烯富集途径的热图。f，临床亚型中髓细胞簇的比例。采用双侧t检验确定组间两两比较均值的统计学显著性(n = 26;TNBC 11例，ER+ 10例，HER2+ 5例)。P量的值用星号:* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001。g，骨髓细胞中PD-L1和PD-L2表达值的小提琴图。c和f中的箱形图分别将第一和第三四分位数描述为下界和上界。须表示四分位数范围的1.5倍，中心表示中位数。
图8间充质细胞状态和亚簇的补充数据。
a, t-SNEvisualization CAFs, PVL细胞和内皮细胞使用Seurat重新聚类默认分辨率参数(0.8)。b, CAFs、PVL细胞和内皮细胞的伪时间图，用单片镜测定。坐标见主图5c、5e、5g。c，覆盖单片源性细胞状态的CAFs、PVL细胞和内皮细胞的t-SNE可视化。d, CAFs、PVL细胞和内皮细胞的热图显示了使用MAST方法确定的所有差异表达基因的细胞状态平均对数归一化表达值，并突出显示了选择的基质标记。e，每种间充质细胞状态的前10个基因本体(GO)，使用ClusterProfiler以所有差异表达基因作为输入，通过途径富集确定。f，使用AUCell测定的胰腺导管腺癌肌成纤维细胞样、炎症样和抗原呈递CAF亚群的基质细胞状态平均特征评分。g、在不同基质细胞状态下抗原呈递CAF标记物CLU、CD74和CAV1的富集。h，使用Seurat测定的caf、PVL细胞和内皮细胞的亚群显示出与三种正常乳腺组织数据集的强整合，突出了不同疾病状态和乳腺癌临床亚型的亚群的相似性。i，使用单片片测定的CAFs、PVL细胞和内皮细胞的细胞状态与三种正常乳腺组织数据集和乳腺癌临床亚型具有很强的整合性。
图9空间转录组学的补充数据。
a，使用Visium (TNBC: CID4465, 1142243F和1160920F)分析其余5个乳腺肿瘤的H&E图像;ER+: CID4535和CID4290)。比例尺代表500 μm。b，使用立体镜估计的癌症反褶积值直方图。红线表示用于选择乳腺癌基因模块评分点的10%截止点。斑点由病理注释着色。c，所有癌症过滤点的基因模块评分的箱形图，由AUCell确定，按样本分组(TNBC=红色;呃=蓝色)。统计学显著性采用双侧t检验，p值采用Benjamini-Hochberg程序调整。箱形图分别将第一和第三个四分位数描绘为下限和上限。须表示四分位数范围的1.5倍，中心表示中位数。P量的值用星号:* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001。d，聚类基因模块在所有癌症过滤点之间的相关性。色阶表示Pearson相关值，并按GM (n)进行缩放。S '表示不显著;双侧相关系数，Benjamini-Hochberg校正p值< 0.05)。e，炎症样CAFs、肌成纤维细胞样CAFs、巨噬细胞CXCL10/c9、LAM1和LAM2簇的反褶积值热图。斑点(列)按样本和病理分组。反卷积丰度(行)按细胞类型缩放。f，预测icaf和CD4/CD8+ t细胞富集的组织点信号。scRNA-Seq检测到的caf配体和t细胞受体的斑点过滤。细胞信号传导对的平均相互作用分数被定义为配体和受体表达的产物。g, PD-1 (PDCD1;y轴)表达PD-L1 (CD274;x轴)或PD-L2 (PDCD1LG2;通过立体镜检测CD4/CD8+ t细胞和LAM2细胞在富集点的表达。CD4/CD8 t细胞(这里合并为T_cell)和LAM2的丰度覆盖在表达图上。
图10 CIBERSORTx细胞型反褶积补充图。
a, 45种细胞类型的scRNA-Seq捕获的实际细胞组分与CIBERSORTx伪批量表达谱预测的细胞组分之间Pearson相关性的条形图和箱线图(插图)(*表示显著性p < 0.05，双侧相关系数)。嵌框图将第一和第三个四分位数分别描述为下限和上限。须表示四分位数范围的1.5倍，中心表示中位数。b, Barplot比较scRNA-Seq捕获的实际细胞组分与伪批量表达谱中CIBERSORTx(红色)和DWLS(蓝色)预测组分之间细胞类型的Pearson相关性(*表示显著性p < 0.05，双侧相关系数)。c，比较每个METABRIC肿瘤中CIBERSORTx预测的sc亚型和循环细胞分数的箱线图，按PAM50亚型分层(n = 1,608;209 Basal, 224 Her2, 700 LumA, 475 LumB)。箱形图如图b. d所示，当在伪大样本上使用CIBERSORTx时，将使用CIBERSORTx生成的生态型与所有32种显著相关的细胞类型(行)相结合，鉴定出由常见METABRIC肿瘤形成的生态型热图(列)。e-f，结合CIBERSORTx一致聚类结果，各生态型中PAM50亚型(e)和主要细胞类型(f)的相对比例。g-h，在结合CIBERSORTx一致聚类结果时，每个生态型中所有常见肿瘤患者(g)和生态型E4和E7中肿瘤患者(h)的Kaplan-Meier (KM)图。使用log-rank检验计算p值。i-j, CIBERSORT与DWLS联合产生的常见肿瘤PAM50分子亚型(i)与主要细胞类型(j)的相对比例。k，结合CIBERSORT和DWLS生成的生态型形成的E4和E7生态型肿瘤患者的KM图。使用log-rank检验计算p值。l、使用CIBERSORTx在所有细胞类型中确定的每个生态型中肿瘤的METABRIC整合簇注释的相对比例。
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吴绍忠，al - eryani, G.， Roden, D.L.等。人类乳腺癌的单细胞和空间分辨图谱。中国生物医学工程学报，2016,33(2):444 - 444。https://doi.org/10.1038/s41588-021-00911-1
收稿日期:2020年9月11日
录用日期:2021年7月8日
发布日期:2021年9月6日
发行日期:2021年9月
DOI: https://doi.org/10.1038/s41588 - 021 - 00911 - 1
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