摘要
µ-阿片肽受体(MOPR)刺激改变呼吸、镇痛和奖励行为，并可诱导药物滥用和过量1,2,3。尽管具有明显的重要性，但MOPR调节完满行为的内源性机制仍然未知。在这里，我们报告了内源性MOPR对小鼠奖励消耗的调节通过特定的中缝背到伏隔核的投影起作用。MOPR介导的中隔末端抑制是决定终性反应的必要和充分条件，而选择性含有脑啡肽的伏隔核群在奖赏消耗之前被参与，这表明局部脑啡肽释放是内源性MOPR配体的来源。伏隔核脑啡肽神经元的选择性调节和crispr - cas9介导的脑啡肽破坏证实了这一发现。这些结果分离出一个基本的内源性阿片回路，用于依赖状态的消费行为，并提出了阿片调节奖励的其他机制。
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致谢
我们感谢L. Lawson, D. Blumenthal, M. Chung, T. Hobbs和C. Pizzano对动物群体的维护;Bruchas实验室，Stuber实验室和NAPE中心内的多名学员和教师进行有益的讨论;B.对Oprm1fl/fl小鼠进行Kieffer;G. Scherrer为penk - cree小鼠。dc由NIH拨款NS007205, DA043999, DA049862和DA051489资助。C.E.P.由NIH拨款DA051124资助。M.A.R.由NIH拨款DK121883和NARSAD青年研究者奖资助。J.A.M.由NIH拨款DA041781, DA042499和DA045463资助。G.D.S.由DA032750、DA038168和DA048736资助。M.R.B.由NIH拨款R37DA033396和R61DA051489以及Mallinckrodt捐赠教授资助。M.R.B, G.D.S.和L.S.Z.由NIH拨款P30DA048736资助。
作者信息
作者及单位
贡献
dc设计并进行实验，收集和分析数据，并撰写手稿。c。s。o。e。t。z。a。g。做了实验，收集了数据。M.A.R.收集并分析了电生理数据。A.C.H.和L.S.Z.设计并分析了CRISPR病毒。C.E.P设计并分析了纤维光度测定数据。sccp设计并分析了单光子数据。M.R.B.和J.A.M.为Oprm1fl/fl × Penk和Oprm1fl/fl × Pdyn小鼠细胞系的生成提供了资源。j.a.m.、L.S.Z.和G.D.S.帮助设计实验、讨论结果和撰写手稿。M.R.B.帮助领导了实验的设计、分析、监督、讨论结果、提供资源和撰写手稿。
相应的作者
道德声明
相互竞争的利益
作者声明没有利益冲突。
额外的信息
《自然》杂志感谢Brigitte Kieffer, Christian lscher和其他匿名审稿人对这项工作的同行评议所做的贡献。
施普林格·自然对已出版地图的管辖权要求和机构关系保持中立。
扩展数据图和表
扩展数据图1 macsh中的内源性MOPR激活对于增强状态依赖的完善行为是必要的。
a.每个微喷油器尖端位置图(蓝色=与无车相比进气抑制，绿色=与无车相比进气增强)。b.向伏隔核(NAc)内侧壳周围区域注射载体(灰色，顶部)或药物(CTAP，蓝色，底部)的示意图。c.与注射在NAc内侧壳外的对照日(n = 8)相比，CTAP(蓝色)对随意进食或饥饿感增强摄入没有影响。d. NAc内侧壳中Pdyn、Penk和Oprm1的原位杂交(刻度条= 200µm)。e, f. macsh中MOPR表达的定量。g. Oprm1fl/fl与Pdyn-Cre小鼠杂交示意图。h, i. Oprm1fl/fl x Pdyn- cre小鼠NAc内壳(标尺= 200µm)中Pdyn、Penk和Oprm1的原位杂交(h)和定量(i)。j.与Pdyn-Cre-同窝对照小鼠(n = 9 Cre-， 10 Cre+)相比，Pdyn-Cre+神经元上mprr的缺失并未破坏正常的自由活动或食物剥夺增加的摄入量。k和l. Oprm1fl/fl x Penk- cre小鼠NAc内壳(标尺= 200µm) Pdyn、Penk和Oprm1的原位杂交(k)和定量(l)。m. rAAV5-CMV-Cre-GFP注射到Oprm1fl/fl小鼠NAc内侧壳的示意图和图像。n.局部MOPR缺失联合病毒传播图示意图。o.左图为AAV2retro-CMV-myc-NLS-Cre或AAV2retro-GFP-Cre注射到NAc的示意图(上)和图(下);中缝背核逆行标记细胞(右)。所有误差条表示±SEM, n =生物独立的小鼠或细胞(f, i, l)。中位数用橙色条标记。事后p值由Sidak多重比较的双向方差分析得出(c, j)。
图2 macsh中内源性MOPR激活对于增强状态依赖的回避行为是必要的。
a.高架零迷宫(EZM)试验示意图。小鼠在适应试验室(无约束)或约束应激(约束)30分钟后进行测试。b.野生型(WT，左)或Oprm1 KO (KO，右)在没有约束(上)或约束30分钟(下)后在EZM张开的手臂上花费的时间示例热图。c.未受约束的WT小鼠在张开的双臂中进行约30%的EZM试验。受到约束压力的小鼠的探索次数显著减少至10%。纳洛酮预处理可预防约束性回避。Oprm1 KO小鼠在约束后不表现张开手臂回避行为。约束后，小鼠对张开双臂的回避表现正常(n = 9只WT无约束，9只WT有约束，8只Oprm1 KO无约束，7只Oprm1 KO有约束，8只Oprm1fl/fl × Penk-Cre-有约束，9只Oprm1fl/fl × Penk-Cre+有约束)。d.食物剥夺或限制后的摄食量测定示意图。e.被剥夺食物的小鼠相对于自由试验日的摄入量正常增加。与不受约束的小鼠相比，受到约束的小鼠的食物摄入量没有增加(n = 11只被剥夺，10只被限制)。所有误差条代表±SEM和n =生物独立小鼠。中位数用橙色条表示。事后p值由Sidak多重比较的双向方差分析得出(c, e)。
图3 LDRN扩展数据Penk-NAc预测表示mopr。
a.注射到伏隔核内侧壳后，Penk-Cre+小鼠杏仁核逆行荧光标记细胞。b.(左)Oprm1、Slc32a1和Slc17a6在DRN中的原位杂交(比例尺= 200µm)。放大和通道分离图像(右)的红色方块在左面板。d、e.伏隔核壳局部注射aav2retror - gfp - cre示意图和图像(比例尺= 200µm)。放大后的图像被指定为红色(i)和黄色(ii)框。f.(左)中缝背核Oprm1、Penk和Cre的原位杂交(比例尺= 200µm)。放大和通道分离图像(右)的红色方块在左面板。g.面板f的原位定量。h. CTb实验示意图。i.将荧光标记的CTb注射到macsh中(标尺= 200µm)。j.中缝背核中观察到CTb标记的细胞，包括图2a中标记脑啡肽神经元的外侧部位(标尺= 200µm)。红色方块显示放大的图像(右)，带有标记的单元格(用白色箭头表示)。所有误差条表示±SEM和n =生物独立细胞。
图4非drn位点不介导食物剥夺对蔗糖消耗的增强作用。
a. Oprm1fl/fl小鼠室旁丘脑局部MOPR缺失并未减少食物剥夺后增加的摄食(n = 8，配对t检验t(7) = 9.634, p < 0.001)。b.腹侧苍白球或杏仁核基底内侧的局部半胱天冬酶消融示意图。c.相对于Cre对照组小鼠(n = 8 Cre-， 9 VP, 7 BMA)，局部和细胞类型特异性消融VP或BMA的脑啡肽神经元并没有减少食物剥夺的增加摄入量。d.腹侧苍白球Caspase注射部位确认(比例尺= 200µm)。共注入AAV2-FLEX-taCas3-TEPp和AAV5-hsyn-EYFP进行细胞类型特异性缺失和非特异性标记。e, f.将AAV5-Ef1a-DIO-EYFP局部注射到DRNPenk(标尺= 200µm)的示意图和图像。g.来自e的背缝投影纤维图像(比例尺= 200µm)。h. DNQX的应用降低了oEPSC振幅(n = 8)。蓝色阴影区域表示光刺激的持续时间。i.应用gabazine降低了oIPSC振幅(n = 5)。所有误差条表示±SEM, n =生物独立的小鼠或细胞(h, i)。事后p值来自Sidak多重比较(c)的双向方差分析(two -way ANOVA)或双尾配对t检验(h, i)。
图5 LDRN扩展数据MOPR- macsh投射活性以阿片受体依赖的方式受蔗糖消耗的负调节。
a.光度法示意图和自愿蔗糖消耗范例。b. DRNPenk中GCaMP6s的表达(左，标尺= 200µm)和mNAcSh中纤维的放置(标尺= 200µm)。c.相对于自由摄取量(白色)，FD增加了食物摄取量(绿色)，并被全身纳洛酮(蓝色，n = 8)所减少。d.自由摄取量/生理盐水(白色)、剥夺食物/生理盐水(绿色)和剥夺食物/纳洛酮(蓝色)测试日的饮食微观结构。在食物剥夺后，大多数蔗糖颗粒在多次颗粒回合中被消耗(左图)，并且每次多次颗粒回合被吃掉更多的颗粒(右图)。这种饮食行为的转变被纳洛酮削弱了。e.光度实验中405nm和470nm的原始通道示例。f.在剥夺食物的测试日，突出显示特定单颗粒(黑色)或多颗粒(绿色)摄入事件的生df/f痕迹示例。顶部的彩色框扩展了下面轨迹的颜色匹配部分。橙色线表示颗粒消耗的开始。g.在FD/生理盐水条件下(绿色)和FD/纳洛酮条件下(蓝色)，平均z得分轨迹与LDRNPenk-mNAcSh终端多粒消耗的开始一致。h.自由测试当天的平均z得分轨迹(暗线)和误差。当GCaMP活性与随意进食的每个颗粒的起始时间一致时，活性未观察到显著偏差(黑色，顶部)。当对准多颗粒回合开始时，没有偏离基线活动(底部棕色)。i.调节食物摄入范式示意图。每90-150秒非偶然递送两粒颗粒，持续30分钟。小鼠在FD/生理盐水或FD/纳洛酮条件下进行测试。j.在调节摄入模式下食用的蔗糖颗粒总数。小鼠在食物剥夺/生理盐水测试日(绿色)明显吃了更多的颗粒，在全身纳洛酮(蓝色)(n = 10) k后减少到基线水平。平均z得分痕迹与LDRNPenk-mNAcSh多颗粒消耗的开始一致。食物剥夺/生理盐水痕迹(绿色)显示出快速和持续的抑制。食物剥夺/纳洛酮痕迹(蓝色)显示反应迟钝。1 .所有被试小鼠在剥夺食物/生理盐水(绿色)或剥夺食物/纳洛酮测试日的个体试验热图。橙色线表示颗粒消耗的开始。m.量化多球球回合开始前20秒和开始后20秒的平均z分数。FD/生理盐水痕迹(绿色)显示GCaMP6s活性显著降低，而FD/纳洛酮痕迹(蓝色)没有(n = 10)。所有误差条代表±SEM和n =生物独立小鼠。事后p值由Sidak多重比较的双向方差分析得出(c, j, m)。
图6 LDRN上MOPR的激活MOPR-mNAcSh足以增强圆满行为。
a.尾浸试验示意图。小鼠在0时进行测试，注射吗啡(5mg/kg, s.c)，然后每10分钟测试一次，持续60分钟，然后在90分钟再次测试。b. WT, Oprm1 KO和Oprm1 KO x Penk-Cre救援小鼠在0时均显示相似的基线反应。吗啡给药后，WT小鼠甩尾潜伏期明显增加，而Oprm1 KO和Oprm1 KO x Penk-Cre对吗啡小鼠无镇痛反应(n = 5 WT, 2 Oprm1 KO, 6 Oprm1 KO x Penk-Cre;WT/T0 vs Oprm1 KO/T0 p = 0.116, WT/T0 vs Oprm1 KO x Penk-Cre rescue/T0 p = 0.063, WT/T10 vs Oprm1 KO/T10 p < 0.001, WT/T10 vs Oprm1 KO x Penk-Cre rescue/T10 p < 0.001, WT/T90 vs Oprm1 KO/T90 p < 0.001, WT/T90 vs Oprm1 KO x Penk-Cre rescue/T90 p < 0.001)。WT与Oprm1 KO的统计差异为(***)，WT与Oprm1 KO x Penk-Cre救援的统计差异为(+++)。c.单个老鼠舔食事件的栅格图，通过试验分开。只包括老鼠被舔的实验。d. ChR2实验示意图。e. eyfp标记的ChR2在LDRNPenk细胞体中的表达(左，标尺= 200µm)和纤维在mNAcSh中的放置(右，标尺= 200µm)。f.在无激光条件下，Penk-Cre-和Penk-Cre+小鼠舔糖溶液的量相似。ChR2光刺激没有减少舔舐(n = 7 Cre-， 6 Cre+)。g.在WD/无激光条件下，Penk-Cre-和Penk-Cre+小鼠舔食糖溶液的量相似。相比之下，ChR2光刺激显著减少Cre+舔舐，但不减少Cre舔舐。h. WD条件下一只Penk-Cre+小鼠个体舔食事件的栅格图，以试验分隔。只包括老鼠被舔的实验。与无激光试验日相比，ChR2光刺激破坏了舔鼠行为。所有误差条表示±SEM, n =生物独立的小鼠或细胞(a)。事后p值来自Sidak多重比较的双向方差分析(c, f, g)。
扩展数据图7 macsh脑啡肽能群受生理状态调节，并增强完满行为。
a.在随意进食和剥夺食物的测试日期间消耗的蔗糖(n = 5)。迷你头戴式耳机没有破坏正常的摄入行为。b.单个细胞轨迹与多颗粒回合起始一致的例子。c.在没有食物的测试日，所有被跟踪的细胞的平均痕迹与大约消耗一致。d.任意状态下多球团簇的TSNE图。e.启动激活神经元的平均轨迹(簇1)。f.启动前激活神经元的平均轨迹(簇2)。g.脑啡肽神经元亚群的总比例和重叠，由多颗粒(粉色)、食物嗅(橙色)、饲养(蓝色)和梳理(棕色)调节。h.通过kmeans聚类排序的食物嗅闻行为的TSNE(左)和平均z得分轨迹(右)。i.通过kmeans聚类对饲养行为的TSNE(左)和平均z得分轨迹(右)进行排序。j.通过kmeans聚类排序梳理行为的TSNE(左)和平均z得分轨迹(右)。所有误差条表示±SEM (a)，或者SEM由迹线(c, e, f, h, i, j)周围的阴影区域表示。
图8糖消耗过程中mmnacsh或pomc神经元的调节。
a. hM3D(Gi)(左)和hM3D(Gq)(右)DREADD实验示意图。b. hM3D(Gi)(左)和hM3D(Gq)(右)实验中，macsh中mcherry标记的脑啡肽细胞的荧光显微照片(比尺= 200µm)。c. CNO注射抑制Cre+小鼠的饥饿感，增加摄入，但对Cre-小鼠没有影响(n = 15 Cre-， 12 Cre+)。d. CNO注射增加了Penk-Cre+小鼠的摄食量，高于已经升高的食物剥夺摄食量，但对Penk-Cre-小鼠没有影响(n = 7 Cre-， 10 Cre+)。e.全身CNO给药(3mg/kg, i.p.)抑制了Penk-Cre+小鼠已经很低的随意摄入量，但没有减少Penk-Cre-小鼠的摄入量。f.全身CNO给药(3mg/kg, i.p.p)对Penk-Cre-或Penk-Cre+小鼠的随意摄入量没有影响。g. POMC-Cre小鼠弓形核注射Gq或Gi DREADD。h. mccherry标记的弓形核中表达dreadd的细胞的显微象形图(标尺= 200 μm)。i (k。在Cre-或Cre+小鼠中，Gi和Gq刺激对随意进食或剥夺食物摄入均无影响(n = 7 Cre-， 7 Gq, 9 Gi)。所有误差条代表±SEM和n =生物独立小鼠。事后p值由Sidak多重比较(c, d, e, f, i, j, k)的双向方差分析得出。
扩展数据图9 macsh内的内源性mu-阿片肽是增强完成人行为所必需的。
a. machsh caspase注射FISH(比例尺= 200µm)。b. (a)的FISH定量。c. mmnacsh CRISPR注射的FISH(比例尺= 200µm)。d. (c)的FISH定量。e. CRISPR病毒开发和验证示意图。f. GFP+细胞核测序:(上)sgPenk序列，PAM下划线，SaCas9切割位点用黑色箭头表示。(中)Sanger测序结果显示从SaCas9预测切割位置开始的多个峰。(下)切割位点前十个突变，左边是发生的百分比。插入:强调。删除:用“-”号标记。SaCas9插入后的受影响部位:棕色阴影。g.野生型(黑色)、缺失(棕色)、插入(粉色)和碱基变化(白色)占GFP+和GFP-核总读取量的百分比。h. GFP+细胞核中Penk插入(粉色)和缺失(棕色)的频率分布。Sanger测序结果显示，SaCas9预测切割位点处没有异常峰。j.单侧击中或双侧未击中NAc内侧壳并缺失CRISPR介导的脑啡肽(enkephalin)并没有减少食物剥夺，增加摄入(n = 4)。k.中缝背核CRISPR病毒表达的荧光电镜图。l.中缝背核中脑啡肽的缺失并没有减少食物剥夺后的增加摄入量(n = 8)。NAc内侧壳中肌啡肽的缺失并没有减少食物剥夺后的增加摄入量(n = 7)。n.在CRISPR/生理盐水(橙色)或对照/生理盐水(灰色)试验日中所有受试小鼠的个体试验热图。橙色线表示颗粒消耗的开始。o.平均z评分与全身纳洛酮注射后LDRNPenk-mNAcSh多粒消耗的开始一致。对照组小鼠(蓝色)表现出迟钝的抑制作用。表达crispr的微量(棕色)表现出可忽略不计的阶段性抑制。p.在CRISPR/纳洛酮(橙色)或对照/纳洛酮(蓝色)测试日中所有受测小鼠的单个试验热图。q.量化多球球回合开始前20秒和开始后20秒的平均z分数。控制线(蓝色)和CRISPR线(棕色)都没有显示出GCaMP活性的显著偏差。一些小鼠在纳洛酮治疗后没有舔食，因此没有被纳入本分析(CRIPSR n = 3, Control n = 3)。所有误差条代表±SEM和n =生物独立的小鼠或细胞(b, d)。事后p值来自Sidak多重比较的双向方差分析(q)或双尾配对t检验(j, 1, m)。
扩展数据图10 A LDRNMOPR-mNAcShPenk回路介导完善行为的增强。
自愿蔗糖消耗任务示意图(左上)和LDRN-mNAcSh投影(右上)。ldrnmopr - macshpenk手法对行为(左下)和假设生理示意图(右下)的影响。
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卡斯特罗，d.c.，奥斯威尔，c.s.，张，E.T.等。内源性阿片回路决定状态依赖性奖励消耗。《自然》，598,646-651(2021)。https://doi.org/10.1038/s41586-021-04013-0
收稿日期:2021年1月20日
录用日期:2021年9月9日
发布日期:2021年10月13日
发行日期:2021年10月28日
DOI: https://doi.org/10.1038/s41586 - 021 - 04013 - 0
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