摘要
许多转移rna的转录后修饰在翻译中起着至关重要的作用。2-甲基硫代- n6 -异五烯基腺苷(ms2i6A)修饰发生在反密码子36位腺嘌呤的转运rna的37位(A37)，有助于促进A:U密码子-反密码子碱基的有效配对，并防止近同源物的非预期碱基配对，从而提高翻译保真度1,2,3,4。ms2i6A修饰是由自由基s -腺苷蛋氨酸(SAM)甲基硫转移酶MiaB安装到异戊烯腺苷(i6A)上的。作为一种自由基SAM蛋白，MiaB含有一个[Fe4S4]RS簇，用于SAM的还原裂解，形成一个5′-脱氧腺苷基5′-自由基，负责去除底物的C2氢5。MiaB还含有一个辅助的[Fe4S4]aux簇，该簇参与了硫向i6A37的C2转移6,7,8,9。这种转移是如何发生的在很大程度上是未知的。本文介绍了均匀拟杆菌中MiaB的几种结构。这些结构符合两步机制，其中一个SAM分子首先用于甲基化辅助性簇的桥接微硫离子。在第二步中，第二个SAM分子被切割成一个5′-脱氧腺苷基5′-自由基，它从底物中提取C2氢，但只有在C2从sp2再杂交到sp3之后。这项工作促进了我们对酶如何功能化与硫的惰性碳氢键的理解。
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本文报道的晶体结构的原子座标和结构因子已被沉积到PDB中，编号为7MJZ(含五硫桥的天然结构)、7MJY(含SAH和13-mer RNA的结构)、7MJV(含SAM和17-mer RNA的结构)、7MJX(含5 -dAH+Met和13-mer RNA的结构)和7MJW(含预甲基化BuMiaB和5 -dAH+Met和13-mer RNA的结构)。
参考文献
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致谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院(NIH) (GM-122595 to S.J.B.;AI133329到S.C.A.和T.L.G.;GM-127079到C.K.;和GM118393, GM093342和GM094662到S.C.A.)，国家科学基金会(MCB-1716686到S.J.B.)， Eberly家族杰出科学主席(S.J.B.)， Price家族基金会(S.C.A.)和宾夕法尼亚州立大学Huck生命科学研究所(N.H.Y.)。s。j。b。是霍华德·休斯医学研究所的研究员。这项研究使用了先进光子源的资源，先进光子源是美国能源部(DOE)科学办公室用户设施，由阿贡国家实验室根据合同编号。DE-AC02-06CH11357。转基因/CA@APS的使用全部或部分由国家癌症研究所(ACB-12002)和国家普通医学科学研究所(AGM-12006)的联邦资金资助。GM/CA-XSD的Eiger 16M探测器由NIH拨款S10 OD012289资助。LS-CAT第21部门的使用得到了密歇根经济发展公司和密歇根技术三走廊的支持(拨款085P1000817)。这项研究还使用了伯克利结构生物学中心的资源，该中心的部分资源得到了霍华德休斯医学研究所的支持。先进光源是美国能源部科学用户设施办公室根据合同编号。DE-AC02-05CH11231。ALS-ENABLE光束线部分由美国国立卫生研究院、美国国家普通医学科学研究所资助，拨款P30 GM124169。
作者信息
作者及单位
贡献
o.a.e.、t.l.g.、N.H.Y.和S.J.B.制定了研究计划和实验策略。O.A.E.和T.L.G.分离并结晶蛋白质并收集晶体学数据。O.A.E, B.W.和A.J.A.进行了生化实验。O.A.E, t.l.g.， N.H.Y, S.C.A, C.K.和S.J.B.分析和解释了晶体学数据。o.a.e.、t.l.g.、N.H.Y.和S.J.B.写了手稿，所有其他作者都对它进行了审查和评论。
相应的作者
道德声明
相互竞争的利益
作者声明没有利益冲突。
额外的信息
同行评议信息《自然》感谢匿名审稿人对本文同行评议的贡献。
施普林格·自然对已出版地图的管辖权要求和机构关系保持中立。
扩展数据图和表
扩展数据图1部MiaB和TmRimO结构。
a, BuMiaB(蓝色)和TmRimO (PDB:4JC0)(灰色)结构的卡通叠加。b、TmRimO的静电表面电位(蓝色为正，红色为负，灰色为中性)。c, BuMiaB和TmRimO的氨基酸序列比对。BuMiaB的整体结构与TmRimO相似，两个独立的RimO分子在324和329 Cαs上的rmsd分别为1.5和1.6 Å(表S1)。在RimO x射线晶体结构中，两个[Fe4S4]簇相距7.3 Å(每个簇中最近的离子)，并通过跨越每个簇的独特(非半胱氨酸连接)铁的五硫化物桥连接。在BuMiaB结构中也观察到同样的五硫桥，其中簇间距为6.8 Å(见扩展数据图2a)。
扩展数据图2 RNA结合到所有三个结构域部MiaB。
a, BuMiaB活性位点的卡通表示与跨越两个[Fe4S4]簇的五硫桥。mtase结构域;自由基SAM域，灰色;TRAM区域，绿色。b, BuMiaB的卡通在13-mer RNA底物和5'dAH +Met存在下结晶，并显示13-mer在三个结构域界面的结合(紫色)。c，静电表面电位(蓝色为正电，红色为负电，灰色为中性)表示一个带正电的活性位点区域促进13-mer的结合。d，从CONSURF服务器推断的活性位点区域氨基酸的保守性42。
图3 13-mer结合的ACSL结构比较部MiaB与全长tRNA板式换热器绑定到TmMiaA。
a，与BuMiaB和5 ' -dAH+Met配合物中的13-mer(核苷酸29-41)结构(紫色)与Tm tRNAPhe与MiaA配合物(棕色)的卡通覆盖(PDB ID: 2ZM5)。b, 13-mer与BuMiaB之间形成氢键示意图。
图4 17-mer绑定的ACSL结构比较部MiaB与全长tRNA板式换热器绑定到TmMiaA。
a, 13-mer(紫色)和17-mer(核苷酸27-43)(绿色)结构与BuMiaB + 5 ' -dAH+Met (13-mer)或BuMiaB与SAM (17-mer)配合，与Tm tRNAPhe与MiaA(棕褐色)配合(PDB ID: 2ZM5) (PDB ID: 2ZM5)。b, 17-mer与BuMiaB之间形成的氢键示意图。
扩展数据图5部含有反密码子34和35核苷酸的MiaB。
含有13-mer RNA和5'dAH +Met的BuMiaB结构以粉红色表示，含有17-mer RNA和SAM的BuMiaB结构以褐红色表示。a，活性位点与G34的相互作用。G34常被改造，其基底在深裂带中插入TRAM和RS结构域之间，为改造提供了空间。在BuMiaB与5 ' -dAH+Met和13-mer配合物的结构中，G34的N10位于RS结构域Ser388的h键距离内。2 '和3 '羟基与Arg418的两个氮原子成氢键，这些氮原子来自tram结构域的胍基。在含有SAM和17-mer的BuMiaB结构中，G34的位置不同，该碱基不再与Ser388和Arg418相互作用(扩展数据图3b, 4b)。b，活性位点与A35的相互作用。在含有5 ' -dAH+Met和13-mer的BuMiaB结构中，Asp319的羧酸氧与A35的N6在h键距离内，而Gln28的侧链与A35的2 ' OH在h键距离内。A35碱基在Phe348和i6A37的腺嘌呤环之间π堆叠。A35在sam束缚结构中的位置发生移位，并以G34和Phe348为一侧的π堆积来稳定。Phe348的旋转支持A35在酶活性位点的两种不同取向。c，结构中BuMiaB活性位点i6A37与13-mer和5'dAH +Met结合，表明异戊烯基位于疏水斑块中。结构域及其相关残基的颜色均相同:棕褐色为mtase，灰色为自由基SAM，绿色为TRAM。
扩展数据图6全长tRNA结合到部MiaB。
a，从CONSURF服务器导出的BuMiaB中残基守恒。色码在面板中有说明。b，静电表面电位，表示能稳定tRNAPhe的带正电区域。c, MTTase结构域残基与全长tRNA相互作用的预测模型。
图7 SAM、SAH和5 ' -dAH与部MiaB。
a, SAM(灰色)，SAH(海蓝宝石)和5 ' dah +Met(浅紫色)在它们与BuMiaB和RNA底物的配合物中的覆盖(SAM为17-mer, SAH或5 ' -dAH+Met为13-mer)。SAM、SAH和5'dAH的腺嘌呤环与Phe321形成面对面的π堆积相互作用。与两个酪氨酸(177,352)和Phe350的边对面相互作用进一步支持这种堆叠。腺嘌呤环的N3与保守的Arg66形成氢键(如图3a所示)，N6与Ile65 (mtase结构域)、Tyr177和Ser353 (RS结构域)的羰基形成3个氢键。SAM、SAH和5'dAH的核糖部分与Arg66、Gln281和Asp319键合。5'dAH +Met结构中的蛋氨酸或SAM(与17-mer RNA结合)和SAH(与13-mer RNA结合)结构中的蛋氨酸部分与[Fe4S4]RS簇的独特铁呈典型双齿结合。b, SAM(灰色)或5 ' dah +Met(浅紫色)与BuMiaB和17-mer RNA (SAM)或13-mer RNA (5 ' -dAH+Met)的复盖。i6A37碱基中含有5'dAH +Met的结构为粉红色，含有SAM的结构为栗色。结构域及其相关残基的所有图都有相同的颜色:mtase为褐色，自由基SAM为灰色，TRAM为绿色，除了5'dAH +Met结构中的Gln215(图a)，它是旋转的。
图8 Arg66→Gln取代对部MiaB活动。
a, 25 μM BuMiaB WT(黑色圆圈)或BuMiaB R66Q(红色圆圈)与1mm SAM在不含二亚硫石的情况下形成SAH的时间过程。b-e, 25 μM BuMiaB与1 mM SAM初始孵育30 min后，加入100 μM i6A ACSL RNA，用1 mM二硫代盐引发反应，SAH (b)， 5'dAH (c)， ms2i6A (d)， i6A衰变(e)的形成时间。黑色对应于在17-mer RNA底物存在下BuMiaB WT获得的数据;蓝色对应于在13-mer存在下获得的数据;红色对应于17-mer存在时BuMiaB R66Q的数据。误差条表示三次重复反应的一个标准偏差，中心表示平均值。
图9预甲基化活性位点电子密度的立体表示部在13-mer RNA底物和5'dAH +Met存在下的MiaB。
BuMiaB的结构在预甲基化和非预甲基化状态下复合物的蛋白质或RNA组分没有任何显著变化[预甲基化亚基A和B与非预甲基化亚基A相比，RMSD分别为0.231 Å (Cα = 371个原子)和0.089 Å (Cα = 439个原子);预甲基化亚基A和B与非甲基化亚基B相比，分别为0.092 Å (Cα = 415个原子)和0.248 Å (Cα = 392个原子)。a, N3处的扩展电子密度。灰色网格对应的是i6A 3.5σ等高线的Fo-Fc省略图，绿色网格对应的是i6A细化后3.0σ等高线的Fo-Fc图。b， [Fe3S4]簇中硫原子的扩展电子密度。该网格对应于3.5σ辅助簇的甲基(绿色)附着在硫(灰色)上的Fo-Fc省略图。c，在非预甲基化辅助簇生成的图中，没有观察到扩展密度。该网格对应于辅助簇的硫原子在3.5σ处轮廓的Fo-Fc省略图。所有残基的结构域都有一个共同的颜色主题:棕褐色为mtase，灰色为自由基SAM。
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Esakova, o.a.， Grove, t.l.， Yennawar, N.H.等。自由基SAM酶MiaB对tRNA甲基硫基化的结构基础。自然，597,566-570(2021)。https://doi.org/10.1038/s41586-021-03904-6
收稿日期:2021年4月5日
录用日期:2021年8月12日
发布日期:2021年9月15日
发行日期:2021年9月23日
DOI: https://doi.org/10.1038/s41586 - 021 - 03904 - 6
这篇文章是由
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trna衍生片段:肺癌基因调控机制及临床应用
细胞肿瘤学(2024)
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四醚类脂质合成酶的发现、结构及作用机制
自然(2022)
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